[发明专利]一种用于牛基因组位点特异性重组的RNA干扰载体及其构建方法和应用

说明书

技术领域

本发明涉及一种RNA干扰载体及其构建方法和应用，特别涉及一种用于牛基因组位点特异性重组的RNA干扰载体及其构建方法和应用，属于生物技术领域。

背景技术

RNA干扰（RNA interference，RNAi）是指在进化过程中高度保守的、由双链RNA（double-stranded RNA，dsRNA）诱发的、同源mRNA高效特异性降解的现象。由于使用RNAi技术可以特异性剔除或关闭特定基因的表达，所以该技术已被广泛用于探索基因功能和传染性疾病及恶性肿瘤的基因治疗领域。

在动物中，RNAi可以通过U6启动表达shRNA来实现。目前的U6载体可以通过2种方式表达在动物细胞内表达：瞬时表达以及稳定表达。稳定表达主要是通过插入基因组中实现的。目前主要通过Gateway技术或者是载体随机插入宿主细胞基因组来完成。这些技术的缺陷是无法进行插入位置的直接准确定位，并且随机插入可能影响目的基因的表达，对基因功能研究或者是转基因动物研究造成不可估计的影响。

为了实现稳定表达细胞系中插入基因组位置的准确定位以及不影响相关基因的表达，本发明通过U6启动子与同源打靶技术相结合，实现了对牛源细胞的精确打靶，并为筛选提供了方便，同时目的插入区域设计为基因与基因之间的scaffold区域，不影响任何基因的表达，同时插入片段长度设计为与缺失长度等同，不改变整体构像，以进一步保证上游及下游基因的表达，为后续实验提供了方便。

发明内容

本发明是结合位点特异性同源重组与RNA干扰（RNAi）技术所发明的特异性插入牛的ITGB6与PLA2R1基因之间scaffold的新型RNAi载体。此处，U6启动子结合同源打靶技术，使得基因组定位更加方便快捷，并且可以确保所筛选工程细胞的非干扰基因表达不受影响。

为了达到上述目的本发明采用了以下技术手段：

本发明的一种用于牛基因组位点特异性重组的RNA干扰载体，其特征在于从5’端开始，包括以下依次相连的各部分：HSV-TK表达元件、用于载体线性化的酶切位点、与牛的scaffold序列上游进行同源重组的同源重组臂1、人U6启动子序列、多克隆酶切位点、人U6终止子序列、含有PCMV启动子的新霉素抗性基因、与牛的scaffold序列下游进行同源重组的同源重组臂2、复制起始位点基因以及氨苄青霉素抗性筛选基因，所述的牛的scaffold序列位于牛的ITGB6基因和PLA2R1基因之间，所述的牛的scaffold序列的GeneBank登录号为NW_003103838REGION:6735248..6760428。

其中，所述的牛ITGB6基因、PLA2R1基因的GeneBank登录号分别为AC_000159、AC_000159REGION:36373939..36508295。

其中，同源重组臂1、2用于与牛的ITGB6与PLA2R1基因之间scaffold进行同源重组；人U6启动子用于表达目的shRNA，用于稳定RNAi；PCMV-NEO用于抗G418抗性细胞的筛选；HSV-TK用于负筛选去除非同源重组的细胞株；复制起始位点（Origin）提供载体在大肠杆菌中的复制信息；氨苄青霉素抗性筛选基因（Amp promoter-amp）用于筛选阳性克隆或者是菌体的大量增殖；位于人U6启动子序列以及人U6终止子序列之间的多克隆酶切位点用于酶切暴露U6启动子与终止信号之间的粘性末端，便于插入目的双链聚核苷酸（ds oligo）。

在本发明中，优选的，所述的与牛的scaffold序列上游进行同源重组的同源重组臂1是以提取自牛肝组织的DNA为模板，通过使用以下引物扩增得到的：

引物F：5’-GACTCAAAGGACTGACATATCTGC-3’

引物R：5’-GACCTGCGTCTCCTGTGTCTCACG-3’；

所述的与牛的scaffold序列下游进行同源重组的同源重组臂2是以提取自牛肝组织的DNA为模板，通过使用以下引物扩增得到的：

引物F：5’-CTAATCCACTGGATTCACTAGGAATG-3’

引物R：5’-CTCCAGGCAAGAATACTGGAGTG-3’。

在本发明中，优选的，所述的多克隆位点序列如SEQ ID NO.2所示。

在本发明中，优选的，所述的载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

进一步的，本发明还提供了一种构建以上任一项所述的RNA干扰载体的方法，其特征在于包括以下步骤：