[发明专利]一种用于牛基因组位点特异性重组的RNA干扰载体及其构建方法和应用

权利要求书

1.一种用于牛基因组位点特异性重组的RNA干扰载体，其特征在于所述的干扰载体依次包括以下相连的各部分：HSV-TK表达元件、用于载体线性化的酶切位点、与牛的scaffold序列上游进行同源重组的同源重组臂1、人U6启动子序列、多克隆酶切位点、人U6终止子序列、含有PCMV启动子的新霉素抗性基因、与牛的scaffold序列下游进行同源重组的同源重组臂2、复制起始位点基因以及氨苄青霉素抗性筛选基因，所述的牛的scaffold序列位于牛ITGB6基因以及PLA2R1基因之间，scaffold的GeneBank登录号为NW_003103838REGION:6735248..6760428。

2.如权利要求1所述的RNA干扰载体，其特征在于所述的与牛的scaffold序列上游进行同源重组的同源重组臂1是以提取自牛肝组织的DNA为模板，通过使用以下引物扩增得到的：

引物F：5’-GACTCAAAGGACTGACATATCTGC-3’

引物R：5’-GACCTGCGTCTCCTGTGTCTCACG-3’；

所述的与牛的scaffold序列下游进行同源重组的同源重组臂2是以提取自牛肝组织的DNA为模板，通过使用以下引物扩增得到的：

引物F：5’-CTAATCCACTGGATTCACTAGGAATG-3’

引物R：5’-CTCCAGGCAAGAATACTGGAGTG-3’。

3.如权利要求1所述的RNA干扰载体，其特征在于所述的多克隆位点序列如SEQ ID NO.2所示。

4.如权利要求1-3任一项所述的RNA干扰载体，其特征在于所述的载体的核苷酸序列如SEQ ID NO.1所示。

5.一种构建权利要求1-4任一项所述的RNA干扰载体的方法，其特征在于包括以下步骤：

（1）同源臂的构建

以提取自牛肝组织的DNA为模板，设计两对引物分别用来扩增同源重组所使用的同源重组臂1以及同源重组臂2：

扩增同源重组臂1所用的引物为

F：5’-GACTCAAAGGACTGACATATCTGC-3’

R：5’-GACCTGCGTCTCCTGTGTCTCACG-3’；

同源重组臂2所用的引物为

F：5’-CTAATCCACTGGATTCACTAGGAATG-3’

R：5’-CTCCAGGCAAGAATACTGGAGTG-3’。

克隆得到的片段分别连接到PMD20-T载体上，得到分别连有同源重组臂1和同源重组臂2的重组载体PMD20-T-LA1及PMD20-T-SA2；

（2）人U6启动子、多克隆酶切位点、人U6终止子序列的构建

以含人U6启动子、多克隆酶切位点、人U6终止子序列的载体为模板，PCR扩增得到含有人U6启动子、多克隆酶切位点、人U6终止子序列的片段，将克隆得到的片段连接到PMD20-T载体上，构建得到PMD20-T-U6；

（3）正筛选基因的构建

新霉素抗性基因NEO以及PCMV启动子以载体PGT-V1为模板进行克隆，NEO的扩增引物为：

F：5’-ACACGATGATAAGCTTGCCAC-3’

R：5’-TTAGCTAGCGAACCTCTTCGAGGGACCTAATAACTTC-3’；

PCMV启动子的扩增引物为：

F：5’-ACGGGATCCATATACGCGTTGACATTGATTATTGAC-3’

R：5’-GTTCCCGGGAGAGCTCTGCTTATATAGACCTCCC AC-3’；

（4）负筛选基因的构建

以载体pORF9-HSV1tk为模板克隆HSV-TK表达元件，HSV-TK的扩增引物为：

F：5’-CGAACRCCGGYCGGATCTGCGATCGCTCCGGTGC-3’

R：5’-CATTTGTCGACGCCCGGGCAAATGGATCTACCACATTTGTAG-3’；

（5）骨架载体的构建

合成多克隆位点，并将其亚克隆到pUC57载体上，构建骨架载体pUC57-MCS，多克隆位点序列如SEQ ID NO.2所示；

（6）元件组装

①HSV-TK的组装：利用克隆得到的HSV-TK上的多克隆酶切位点SgrAI、SalI以及pUC57-MCS上的XmaI、SalI将HSV-TK表达元件，克隆组装为pUC57-K；

②利用PMD20-T-SA2载体上的SpeI与BamHI位点酶切后，将同源重组臂2连接到骨架载体pUC57-K上，构建成为载体pUC57-K2；

③PCMV与NEO基因的组装：将克隆到的PCMV与NEO基因胶回收后，利用基因上的XmaI酶切位点将两个基因拼接成为PCMV-NEO，将PCMV-NEO克隆到载体pUC57-K2上，构建成为载体pUC57-KN2；

④利用PMD20-T-U6上的AgeI与SalI以及PMD20-T-LA1上的XmaI与SalI位点，将同源重组臂1克隆到PMD20-T-U6上，构建成PMD20-T-LA1-U6；利用PMD20-T-LA1-U6上的SalI与ClaI位点将目的片段LA1-U6克隆到pUC57-KN2上，构建成为目的载体PBKN-U6。