[发明专利]产电基因工程菌的构建、菌株及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物工程技术领域，具体涉及一种产电基因工程菌的构建、菌株及其应用。 

背景技术

微生物燃料电池(microbial full cells，MFCs)是一种利用微生物作为生物催化剂将生物质化学能转化为电能的装置，生活和工业污废水中含有的丰富有机物就可以作为其原料来源，从中直接获取电能。微生物电池除了具有很高的能量转化效率外，还有其他燃料电池不具备的若干特点: ①燃料来源多样化；②操作条件温和； ③无污染，可实现零排放； ④无需能量输入；⑤能量利用的高效性; ⑥生物相容性。因此，微生物燃料电池的研究已经成为治理和消除环境污染源，开发新型能源，是新能源研究工作者的关注热点。 

电子传递体是MFC的产电机制之一，它经常被加入到MFC中，从而使细菌甚至酵母能传递电子。通过细胞色素蛋白直接接触进行的电子传递只能在细胞与电子受体直接接触或者纳米级的距离内进行，而事实上，金属异化还原均可以在一定距离外进行，预示这些微生物可以分泌可溶性电子介体类物质还原不溶性电子受体，这使得电子中介体成为近年来的MFC研究热点之一。研究者曾使用多种电子中介体促进电子从胞内向胞外的电子传递。这些外源中介体包括中性红、2，6-蔥醌、铁氰化钾、甲基紫精。常见的内生电子中介体有醌类物质、绿脓素吩嗪类色素等。关于绿脓素化合物的产生原因还不是完全清楚，可能是由于外源电子传递的机制或其他原因产生。这些化合物也具有抗生素特性。因此，分泌这些化合物的主要原因可能是作为呼吸作用的抑制剂或阻止其他竞争者生长。 

铜绿假单胞菌是产电子传递体的主要微生物之一，其主要的产电机制即为产生绿脓素作为电子传递体。绿脓素作为有效的电子传递介体，具备了以下特性：(1) 为亲水性的物质；(2) 氧化还原电位要与生物体电子传递链的氧化还原电位(NADH的氧化还电位是-0.32V)相匹配；(3) 在电极上的氧化还原反应速率非常快，且有很好的可逆性。因此人为提高铜绿假单胞菌中绿脓素的量是提高纯菌产电量的有效措施。 

目前关于铜绿假单胞菌在MFC中应用的文献报道主要集中在绿脓素上。Rabaey等从微生物燃料电池中分离出铜绿假单胞菌，其能够代谢出吩嗪类色素，该类物质(如绿脓菌素)具有电化学活性，能够提高某些细菌的功率输出。目前有研究报道在微生物燃料电池中，以绿脓杆菌为主的混合菌作为微生物源能产生高浓度的电子传递介体，同时电能达到了3.1-4.2 W/m²。此外也有文献报道，在绿脓杆菌接种的微生物燃料电池中检测出了具有电化学活性的绿脓菌素 (pyocyanin)和1-酰胺-吩嗪(phenazine-1-carboxamide)，将这些物质用于由某些微生物接种的微生物燃料电池时可以明显提高电池的电流输出。Rabaey 等以绿脓杆菌为阳极微生物，以铁氰化钾为阴极电子受体，功率密度达到3.1～4.2 W /m² ，研究表明假单胞菌可以通过自身分泌物或代谢产物作为电子传递介体。 

发明内容

本发明的目的在于提供一种产电基因工程菌的构建方法、菌株及其应用。 

为实现上述目的，本发明采用以下技术方案为： 

一株产电基因工程菌菌株，分类命名为铜绿假单胞菌（Pseudomonas aeruginosa）PAO1-phzM，已于2013年1月6日保藏于中国典型培养物保藏中心CCTCC，保藏编号：CCTCC NO：M：2013001，本菌在普通LB培养基中就能生长，因可产生大量绿脓素而使菌落呈深蓝绿色，抗50μg/ml庆大霉素。

上述产电基因工程菌菌株的构建方法，以铜绿假单胞菌PAO1菌株为宿主菌，将甲基转移酶基因phzM插入pBBR1MCS-5载体的EcoRI和SpeI酶切位点之间，再将重组质粒导入表达宿主中，获得产电基因工程菌；具体步骤如下： 

1）以铜绿假单胞菌PAO1基因组为模板，PCR扩增出phzM基因，连接到测序载体PMD19-T Simple载体，经测序与Genebank上公布的序列(Gene ID:880514)比对完全正确后，设计酶切位点EcoRI和SpeI，用限制性内切酶EcoRI和SpeI双酶切phzM基因片段和pBBR1MCS-5载体，得到重组质粒pBBR1MCS-5-phzM；

2）将构建好的重组质粒pBBR1MCS-5-phzM转化至DH5α感受态细胞，得到重组大肠杆菌DH5α-pBBR1MCS-5-phzM，选取阳性克隆；