[发明专利]一种基于核酸适体的可捕获癌细胞的微流控芯片及其制备和癌细胞的分离方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种细胞分离技术，尤其涉及一种可用于癌细胞分离的微流控芯片和分离方法。

背景技术

癌症，亦称恶性肿瘤，其是因控制细胞生长增殖机制失常而引起的疾病。癌细胞除了生长失控外，还会局部侵入周遭正常组织甚至经由体内循环系统或淋巴系统转移到身体其他部分，严重威胁人类健康。癌细胞的捕获，尤其是从原生癌细胞组织上脱落下来进入人体外周血液及组织中的循环癌细胞的捕获，对于癌症的早期诊断、治疗效果的评估有极其重要的意义。在过去的几十年间，人们开发了很多种用以捕获癌细胞的技术，如：荧光免疫法、磁性免疫法等。然而，这些技术所需的仪器昂贵，操作方法复杂，推广难度大。因此，开发一种小型、廉价、操作简单的癌细胞捕获仪器是非常有意义的。

微流控芯片技术由于制作成本低、试剂消耗少、检测速度快、功能集成度高等优点越来越受到研究人员的关注。人们已经逐步利用微流控芯片实现了对循环癌细胞的高通量筛选、计数以及表征等技术。Faley S等利用440 个18μm×18μm×10μm的聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）微结构捕获阵列成功地实现了对CD4+T细胞的捕获（Faley S, Seale K, Hughey J et al, Microfluidic Platform for Real-Time Signaling Analysis of Multiple Single T Cells in Parallel, Lab on a Chip, 2008, 8, 1700-1712）。该设计侧向2μm宽的微小狭缝使得PDMS 在脱模时容易断裂，另外芯片对细胞捕获的选择性不高，会将全血中的红细胞、白细胞和癌细胞同时捕获。这些方法基本上都是基于细胞大小等物理性质、或是基于抗原抗体相互作用的识别分离，所以都没能实现既有高效率、又有高特异性的捕获。

核酸适体（aptamer）是一种从人工合成的DNA/RNA文库中筛选得到的能够高亲和性和高特异性地与靶标分子结合的单链寡核苷酸。1990年Gold研究组运用体外筛选技术获得能与T4 DNA聚合酶特异性结合的RNA，并把该技术定义为指数富集的配基系统进化技术（Systematic Evolution of Ligands by Exponential Enrichment, SELEX）。基于SELEX筛选获得的核酸适体具有比抗体更好的化学性质，能够高效、特异地结合多种目标物质，具有制备修饰简便快速、稳定性好、无毒性、无免疫原性等优点，在生物医学基础研究和临床诊断与治疗方面显示出巨大的应用前景。Joseph A. Phillips等用核酸适体作为捕获探针有效地实现了癌细胞的分离和富集（Joseph A. Phillips, Ye Xu, Zheng Xia et al Enrichment of cancer cells using aptamers immobilized on a microfluidic channel Anal. Chem. 2009, 81, 1033-1039），但该方法由于芯片结构简单，不能很好地解决层流的影响，另外由于核酸适体预先固定在芯片上，其与细胞接触几率小，这使得低浓度下的捕获效率不高。

因此，迫切需要开发一种制作简单、操作方便的细胞捕获分选芯片，以期能够实现高效且高特异性地捕获样品中微量癌细胞的目标。

发明内容

本发明要解决的技术问题是克服现有技术的不足，提供一种细胞捕获效率高、制作工艺简单、操作简便、通用性强、成本低、能在全血中捕获癌细胞的微流控芯片，还提供一种基于该微流控芯片的快速、准确的癌细胞的分离方法。

为解决上述技术问题，本发明提出的技术方案为一种基于核酸适体的可捕获癌细胞的微流控芯片，所述微流控芯片由上层聚二甲基硅氧烷（Polydimethylsiloxane，PDMS）聚合物芯片和下层的玻片载体可逆封接而成，所述微流控芯片上设有进样口和出样口，所述PDMS聚合物芯片和玻片载体之间设有蛇形状的细胞捕获通道，所述细胞捕获通道将所述进样口和出样口连通，所述细胞捕获通道的内上表面设有自上往下突出的鱼骨形结构，所述细胞捕获通道的底表面为凹凸不平的玻片载体表面；所述细胞捕获通道的底表面上固定有亲和素。

上述的微流控芯片中，所述凹凸不平的玻片载体表面是经过氢氟酸腐蚀处理后成型得到。

作为一个总的技术构思，本发明还提供一种微流控芯片的制备方法，包括以下步骤：