[发明专利]猪流行性腹泻病毒变异株检测用引物及其检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及猪流行性腹泻病毒变异株检测用引物及其检测试剂盒。属于生物检测技术领域。

背景技术

猪流行性腹泻（Porcine Epidemic Diarrhea, PED）是由猪流行性腹泻病毒（Porcine Epidemic Diarrhea Virus, PEDV）引起的一种急性、高度接触性的传染病，常以急性肠炎和伴有脱水的水样腹泻为特征，各种年龄的猪均易感。本病于1971年首先发现于英国，此后，欧洲和亚洲各国也报道了该病的暴发。我国在1973年分离到PEDV（经典毒株）。

2010年冬季至2011年春季全国各地猪场的猪群中先后发生严重的传染性腹泻疾病，发病突然，传播较快，流行范围广，流行时间长，应用各种抗生素防治无效，其发病率与死亡率很高，造成重大的经济损失。经研究表明，猪流行性腹泻病毒变异株是此次疫情的元凶（Jianfei Chen等Complete Genome Sequence of a Porcine Epidemic Diarrhea Virus Variant. J. Virol, 2012, 86: 3408）。猪流行性腹泻病毒变异株（Yanjun Zhou等Complete Genome Sequence of a Virulent Porcine Epidemic Diarrhea Virus Strain. J. Virol, 2012, 86: 13862）与原来毒株PEDV（经典毒株）（Jianfei Chen等Complete Genome Sequence of a Chinese Virulent Porcine Epidemic Diarrhea Virus Strain. J. Virol, 2012, 86: 3408）的基因组同源性在97%左右，变异最大的为S基因，同源性在94%以下，且存在氨基酸发生缺失和插入的序列特征（Wentao Li等New variants of porcine epidemic diarrhea virus, China, 2011. Emerg. Infect. Dis, 2011, 85: 11538）。

此前，我国尚无PEDV变异株（命名为PEDV-V）的特异检测技术。常规RT-PCR技术不能区分PEDV（经典毒株）和PEDV-V（PEDV变异株），因此不能特异地检测PEDV变异株。现如今，对猪流行性腹泻病毒变异株的检测只能通过基因测序来确定该病毒的感染，操作繁杂、耗时长、成本较高。 

因此，基于以上的研究和当前的需求，申请人根据猪流行性腹泻病毒变异株S基因发生核苷酸缺失和插入的特征，设计并合成了一对检测猪流行性腹泻病毒变异株的引物，采用RT-PCR方法扩增S基因，通过扩增片段的分子量大小，判断是否存在猪流行性腹泻病毒变异株，从而特异、敏感、省时、省力、低成本地检测出猪流行性腹泻病毒变异株。目前其他RT-PCR方法不能解决该问题；基因测序技术需要时间较长，且费时、费力、成本高。因此，该技术可对猪流行性腹泻病毒变异株的诊断和监测起到重要作用。

 

发明内容

技术问题  

本发明目的在于提供用于PEDV变异株RT-PCR检测的引物序列及其检测试剂盒。

技术方案 

本发明通过分析PEDV变异株的S基因序列，在S基因发生核苷酸插入和缺失的序列处设计引物。所述的引物对由正向和反向引物组成，其核苷酸序列如序列表中的SEQ ID NO. 1和SEQ ID NO. 2所示。

具体地，本发明提供了一种PEDV变异株检测用引物，该引物的正向引物（PEDV-VF）序列SEQ ID NO.1和反向引物（PEDV-VR）序列SEQ ID NO.2的核苷酸序列为：

SEQ ID NO.1：5’-TTGGTGAAAACCAGGGTGTC-3’

SEQ ID NO.2：5’-CAACACTATGTTCACTCA-3’。 该引物从感染猪流行性腹泻病毒变异株的病料提取的总RNA中扩增出327 bp DNA片段。

本发明还提供了一种用于检测猪流行性腹泻病毒变异株的试剂盒，该试剂盒含有上述引物SEQ ID NO.1和SEQ ID NO.2。

具体的，该试剂盒包括：

（1）阴性对照：  取灭菌的DEPC水，置-20℃冰箱保存；

（2）RT反应液：

      无菌DEPC水           4.75μL