[发明专利]一种人类免疫缺陷病毒核酸检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于诊断试剂技术领域，具体涉及一种人类免疫缺陷病毒HIV-1的荧光PCR检测试剂盒。

背景技术

获得性免疫缺陷综合征（acquired immunodeficiency syndrome，AIDS）是由人类免疫缺陷病毒（human immunodeficiencyvirus,HIV）感染而引起的疾病，又称艾滋病。该病患者的免疫功能部份或完全丧失，CD4+细胞（cd4和cd8是T淋巴细胞上的抗原蛋白质，其中cd4+称为辅助性T细胞）数目减少，继而发生机会性感染、肿瘤等，临床表现多种多样。

1981年世界报告首例艾滋病病例至今，在短短30年间，艾滋病已肆虐全球，夺去2500多万人的生命。联合国艾滋病规划署21日发布年度报告，全球2010年艾滋病病毒（HIV）携带者大约3400万人，比2009年增加70万。自1985年我国发现首例艾滋病病人以来，我国艾滋病感染人数逐年上升。中国疾控中心性病艾滋病预防控制中心数据显示，我国累计报告艾滋病病毒感染者和病人43.4万人，其中死亡8.8万人。据联合国艾滋病规划署、世界卫生组织和卫生部联合专家组评估，截至2011年底，估计我国存活艾滋病感染者和病人78万。

HIV感染的病毒学诊断技术一般包括病毒分离和病毒成份（如抗原、核酸）的检测。实验室检测包括病毒蛋白抗体检测、抗原检测、病毒分离培养、核酸检测等方法。其中，抗体检测的初筛试剂主要有酶联免疫吸附试验（ELISA）和免疫荧光试验（IFA）；ELISA用去污剂裂解HIV或感染细胞液提取物作抗原，IFA用感染细胞涂片作抗原进行抗体检测，如果发现阳性标本应重复一次；确认试剂通常采用Western blot（WB，蛋白印迹法），即用聚丙烯酰胺凝胶电泳将HIV蛋白进行分离，再经转移电泳将不同蛋白条带转移于硝酸纤维膜上，加入病人血清孵育后，用抗人球蛋白酶标抗体染色，就能测出针对不同结构蛋白抗体，如抗gp120、gp41、P24抗体，特异性较高。抗原检测则用ELISA检测P24抗原，在HIV感染早期尚未出现抗体时，血中就有该抗原存在；但由于P24量太少，阳性率通常较低；现有用解离免疫复合物法或浓缩P24抗原来提高敏感性。病毒分离培养的常用方法为共培养法，即用正常人外周血液分离单个核细胞，加PHA刺激并培养后，加入病人单个核细胞进行共培养。核酸检测是用PCR法或基于转录的系列复制方法检测HIV基因，具有快速、高效、敏感和特异等优点，目前该法已被应用于HIV感染早期诊断及艾滋病的研究中。

艾滋病病毒进入人体后，机体需要经过一段时间才会产生抗体，在此期间血液抗体检测呈阴性，抗原抗体通常是在感染后3-6周后才能被检测出来。而近几年发展起来的艾滋病核酸检测技术是检查病毒本身的技术，感染七天之后就能检测出来，残余风险度大大下降，能够提前预防，比传统的试纸检测更精确，时间上更为提前。PCR方法虽然灵敏并能在早期对病毒进行检测，但是因其步骤繁琐且容易造成污染，从而使其在使用上收到一定限制。实时荧光定量PCR技术是上世纪90年代中期基于传统的PCR技术发展起来的。与传统的（终点检测）PCR技术相比，实时定量监测方法不仅实现了低拷贝数靶多核苷酸的定量分析，而且还具有特异性和精确度更强、自动化程度更高以及污染的可能性更小等优点。

HIV的基因结构与其它逆转录病毒基本相同，为RNA双分子，其单链RNA分子由9749个核苷酸组成，有3组共9个基因。第一组为逆转录病毒共同的基因，即gag、pol和env基因，及侧翼的长末端重复顺序(LTR)等；其中前述三个基因为病毒的结构基因，编码病毒蛋白，而基因组两端的LTRs，不编码任何蛋白，可起始其它病毒基因的表达，无种属特异性。第二组为调节基因表达的基因，即tat、rev和nef基因，可以增强或抑制其它基因的表达。第三组为特有基因，负调控病毒的感染性，成熟或释放，即vif、vpu和vpr。

根据HIV基因结构、免疫学和流行病学的特征，HIV被分为HIV-1和HIV-2两大类，HIV-1的感染力较强，在世界各地广为流行，而HIV-2主要集中在非洲西部、欧洲、美国，南美的一些地区也偶有报道。