[发明专利]核苷酸序列及其方法

说明书

技术领域

本发明描述了来自巴斯德毕赤酵母(P.pastoris)的山梨醇脱氢酶启动子的鉴别和分离，以及在所述分离的启动子的影响下，巴斯德毕赤酵母中异源蛋白质的表达，具体地人白蛋白(HA)和刺桐胰蛋白酶抑制剂(ETI)的表达。

背景技术

巴斯德毕赤酵母(Pichia pastoris)是广泛使用并且公认的用于生产治疗性重组蛋白的工业宿主。治疗性重组蛋白的生产具有几个问题，如N末端(Prabha等人，2009)或C末端的剪切，所需糖型(glycoform)的引入(Wouter Vervecken等人，2004)。需要提高蛋白产率和质量以满足不断增长的市场需求以及对生物相似性不断增加的调控问题。这可以通过共表达分子侣伴蛋白(Wei Zhang等人，2006)、共表达蛋白酶以获得所需的最终产物来实现。在所有这些情况下，需要额外的启动子来进行遗传操作以改善重组蛋白的品质和数量。

美国专利No.6033898公开了分离自酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)山梨醇脱氢酶基因的DNA部分，其用于提高异源多肽的产生。美国专利No.5139936公开了含有外源基因以及在适当位置上的酵母半乳糖苷酶(GAL1)调控区和启动子的克隆载体以提高外源基因的表达。美国专利No.5089398公开了使用来自甘油醛-3-磷酸脱氢酶的启动子区域控制酵母中外源多肽的表达。

尽管对于毕赤酵母表达系统有几种组成型或诱导型启动子可用，但是在大部分研究和应用中使用了AOX1。AOX1启动子是强诱导型启动子并且受碳源严格控制，当在存在除甲醇外的大部分其它碳源的情况下生长巴斯德毕赤酵母时，表达被高度抑制。甲醇是AOX1启动子的诱导剂(inducer)，由于其高可燃性和毒性，甲醇是危险物品，另外，依靠甲醇生长的细胞具有很高的氧消耗，其通常需要加入纯氧进行培养，因此提高了工艺成本并且限制了大规模培养能力(Monika Bollok等人，Recent Patents on biotechnology,3(2009)192-201)。

另外，从依靠甲醇生长的巴斯德毕赤酵母释放的宿主细胞蛋白质(HCP)很高，其主要在细胞溶解期间获得，但是当用葡萄糖作为碳源生长时，其程度要低得多。因此，细胞维持更高的存活力和更高纯度的分泌蛋白。

此外，酿酒酵母(S.cerevisiae)中鉴别的山梨醇脱氢酶启动子为750bp。由于较大的碱基对大小，它不易于进行遗传操作，因为它将导致载体大小的增加。本发明旨在克服上述问题。另外，在本领域中需要鉴别更多在巴斯德毕赤酵母中用于异源重组蛋白表达而不需要用于蛋白表达的任何特异性诱导的启动子。

发明内容

因此，本发明涉及SEQ ID No.1所示的核苷酸序列；分离SEQ ID No.1的方法，所述方法包括以下行为(act)：a)从巴斯德毕赤酵母分离基因组DNA，b)扩增在分离的基因组DNA内包含SEQ ID No.1的区域，和c)对扩增产物进行常规凝胶洗脱程序(conventional gel elution procedure)以分离所述SEQ ID No.1；在包含非特异性诱导剂的培养基(media)中在SEQ ID No.1的调控(调节，regulation)下表达基因的方法，所述方法包括以下行为：a)在SEQ ID No.1下游的表达构建体(expression construct)中克隆所述基因，b)用所述表达构建体转化宿主，和c)在包含非特异性诱导剂的培养基中在所述SEQ ID No.1的调控下表达所述基因以产生异源蛋白；包含如上所述的核苷酸序列的载体；包含如上所述载体的转化的宿主细胞。

附图说明

图1显示了SDPHA/pMBL208的限制性酶切分析。所有消化产生了预期图谱。

图2显示了SDPHA/pMBL208的载体图。

图3显示了在G418抗生素上选择高重组蛋白产生菌(producer)的集落筛选。箭头所示的集落表示较高抗性的克隆。

图4显示了巴斯德毕赤酵母基因组中整合基因的PCR确认。发现所有所选的克隆具有所关注的基因。

图5显示当使用山梨糖醇作为唯一碳源生长时HA的表达分析。

图6显示当使用甲醇作为唯一碳源生长时HA的表达分析。

图7显示当使用葡萄糖作为唯一碳源生长时HA的表达分析。

图8显示没有任何诱导的不含细胞的上清液的表达分析(细胞在扩增培养基中生长)。