[发明专利]用于诊断人免疫缺陷病毒感染的方法

说明书

本申请要求2011年11月23日提交的美国临时申请号61/563,216的优先权，其公开内容通过引用并入本申请。

关于联邦政府资助研究的声明

本发明在美国国立卫生研究院提供的合同号为HL100928的政府支持下进行。政府享有本发明的某些权利。

发明领域

本发明基本涉及人免疫缺陷病毒感染的检测和诊断，特别是在急性期早期阶段对人免疫缺陷病毒(HIV)感染的检测。

背景技术

急性HIV(AHI)感染是在血清转化之前的感染阶段并且对这一阶段HIV感染的正确诊断目前尚未解决，这会严重影响公众健康——AHI与在感染过程中最高速度的继发性HIV传播具有相关性。

血清转化历来被认为出现在感染后21天左右并且在大多数情况下在感染3至8周内完成，处于AHI阶段的患者采用常规方法如ELISA或Western印迹进行检测时结果将为阴性。并且尽管在临床上可以对AHI进行诊断，但是其症状是不明显的且仅存在于半数感染的个体中。

在AHI期间HIV传播风险的升高，因为事实上AHI的特征为在感染的患者出现获得性免疫缺陷症状(AIDS)之前其具有最高水平的病毒血症，在感染后约21天达到峰值。然后由于出现免疫应答和血清转化导致其急剧下降。事实上，在病毒载量和HIV传播速度之间存在较强的正相关–病毒载量每增加一个对数则传播风险相应增加2.45倍。行为因素也极大促进了在AHI期间HIV传播速度的加快–感染个体在AHI期间很少意识到其感染状态并且可能持续进行导致其感染的活动，这使得未感染的群体处于风险中。因此，对于能够正确诊断AHI存在较大的需求。本发明满足了这种需求。

发明概述

本发明提供了用于检测HIV的工具和方法。所述方法是专门用于检测来自粘膜表面的巨噬细胞中的HIV的。特别地，本发明能够检测在个体中血清转化前巨噬细胞的HIV感染。所述方法包括提供从粘膜表面获得的样品，其中所述样品包含巨噬细胞。将所述巨噬细胞与同HIV mRNA互补的多个荧光标记的寡核苷酸探针接触。所述探针均具有独特的序列并且其同靶标HIV mRNA的互补性是互不重叠的。在特定实施方式中，所述多个探针与HIV Gag mRNA或HIV gp120mRNA互补。在某些实施方式中，所述多个探针能够包含多达并包括48个的探针。

一旦将所述荧光标记的探针引入巨噬细胞，则使用荧光原位杂交(FISH)联合流式细胞术根据所述巨噬细胞发出荧光信号将巨噬细胞鉴定为已感染HIV，或者根据巨噬细胞中不发出或发出不同的荧光信号将巨噬细胞鉴定为未感染HIV。根据样品中存在或不存在HIV的鉴定结果，可以将样品来源的个体分别诊断为HIV阳性或HIV阴性。

在通常情况下，所述方法用于测定来自尚未血清转化出抗-HIV抗体的个体的样品中的HIV感染。在某些方面，所述方法包括通过从粘膜表面分离样品以鉴定HIV感染，所述样品包含巨噬细胞，其中在获得和/或检测样品前，样品中的至少一些巨噬细胞已经在体内被感染了一段时间，如感染16周以内至1天以内。

本发明还提供了包括多个探针的试剂盒，其用于实施本发明的方法。

附图简述

图1A：使用HIV感染来源于PBMC的巨噬细胞并孵育6天以建立感染。然后，将这些巨噬细胞加入DQ BSA小珠并且孵育180分钟以促进荧光报告底物的蛋白水解过程。孵育结束后收集细胞、固定并使用偶联了PE的针对HIV p24蛋白的抗体标记。通过FISH联合细胞分选对所有样品进行分析并与未经处理的DQ BSA颗粒、内化180分钟作为对照的BSA颗粒、未经感染的来源于PBMC的巨噬细胞进行比较(其还使用抗-p25抗体作为探针并且测定为HIV阴性)。图1B。加入PBMC的IgG包被的乳胶小珠(箭头)(120分钟)的电子显微镜照片。乳胶小珠吞噬体不与参与病毒出芽的细胞(箭头位置)相交。在这些区域能够看见小囊泡。

图2：对来自HIV血清阴性(HIV-)和HIV血清阳性(HIV+)个体的肺泡巨噬细胞进行基于FISH的流式细胞术分析的典型图。