[发明专利]酵母中生产古细菌蛋白酶的方法

权利要求书

1.一种在酵母中生产蛋白酶的方法，包括：

(a)提供包括至少一个多核苷酸表达构建体的酵母宿主细胞，所述多核苷酸表达构建体编码与第二多肽翻译融合的由所述宿主细胞分泌的第一多肽，其中所述第二多肽选自：

(i)其成熟部分与SEQ ID NO:2的成熟多肽；优选与SEQ ID NO:2的位置[1-412]具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％氨基酸序列同一性的蛋白酶；

(ii)其成熟部分由与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；优选与SEQ ID NO:1的位置[397-1632]具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％DNA序列同一性的多核苷酸所编码的蛋白酶；

(iii)其成熟部分由在低等严格条件、中等严格条件、中高等严格条件、高等严格条件或极高等严格条件下与SEQ ID NO:1的成熟多肽编码序列；优选与SEQ ID NO:1的位置[397-1632]；或两者中任一者的全长互补物杂交的多核苷酸所编码的蛋白酶；

(iv)SEQ ID NO:2的成熟多肽、优选SEQ ID NO:2的位置[1-412]的变体，其包括在一个或多个位置上的取代、缺失和/或插入；和

(v)(i)、(ii)、(iii)或(iv)多肽的具有蛋白酶活性的片段，

(b)在有益于所述第一多肽的表达和分泌的条件下培养所述宿主细胞，由此分泌翻译融合多肽并生产成熟蛋白酶；和

(c)任选地，回收蛋白酶。

2.根据权利要求1所述的方法，其中所述酵母是酵母属，优选为酿酒酵母(Saccharomyces cerevisiae)。

3.根据权利要求1或2所述的方法，其中，所述第一多肽是全长的或C端截短的天然或异源的酶；优选为水解酶、异构酶、连接酶、裂解酶、氧化还原酶或转移酶，例如氨肽酶、淀粉酶、糖酶、羧肽酶、过氧化氢酶、纤维二糖水解酶、纤维素酶、几丁质酶、角质酶、环糊精糖基转移酶、脱氧核糖核酸酶、内切葡聚糖酶、酯酶、α-半乳糖苷酶、β-半乳糖苷酶、葡糖淀粉酶、α-葡糖苷酶、β-葡糖苷酶、转化酶、漆酶、脂肪酶、甘露糖苷酶、变聚糖酶、氧化酶、果胶分解酶、过氧化物酶、植酸酶、多酚氧化酶、蛋白水解酶、核糖核酸酶、转谷氨酰胺酶、木聚糖酶、或β-木糖苷酶。

4.根据权利要求3所述的方法，其中所述第一多肽是全长的或C端截短的天然或异源的葡糖淀粉酶；优选为选自以下的全长的或C端截短的天然或异源的葡糖淀粉酶多肽：

(a)与SEQ ID NO:6的成熟多肽具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多肽；

(b)由在低等严格条件、中等严格条件、中高等严格条件、高等严格条件或极高等严格条件下与(i)SEQ ID NO:5的成熟多肽cDNA编码序列，(ii)于2009年11月23日保藏于德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ)且分配登录号为DSM23123的大肠杆菌菌株中的质粒AMG1中所插入的AMG基因，或(iii)(i)或(ii)的全长互补物杂交的多核苷酸所编码的多肽；和

(c)由与SEQ ID NO:5的成熟多肽编码序列或与于2009年11月23日保藏于德意志微生物和细胞培养物保藏中心(DSMZ)且分配登录号为DSM23123的大肠杆菌菌株中的质粒AMG1中所插入的AMG基因的成熟多肽编码序列具有至少60％，例如至少65％、至少70％、至少75％、至少80％、至少85％、至少90％、至少91％、至少92％、至少93％、至少94％、至少95％、至少96％、至少97％、至少98％、至少99％、或100％序列同一性的多核苷酸编码的多肽。