[发明专利]用于核酸的振荡扩增反应

说明书

对相关申请的交叉引用

本申请要求于2011年4月20日提交的名称为“用于核酸的振荡扩增反应”的美国临时专利申请号61／477,437的优先权和利益，并且其说明书和权利要求通过引用引入本文。

本申请要求于2011年4月20日提交的名称为“用于核酸检测和鉴定的集成设备”的美国临时专利申请号61／477,357的优先权和利益，并且其说明书和权利要求通过引用引入本文。

关于联邦资助的研究或开发的申明

不适用。

在光盘上递交的材料的通过引用的结合

不适用。

授予版权的材料

不适用。

关于序列表、表格或计算机程序

申请人在此递交序列表，其为文本文件，题为041812_ST25.txt，创建于2012年4月20日，具有10K千字节，符合ASCII，并且通过引用引入本文。

发明背景

发明领域(技术领域)：

本发明的实施方案涉及通过在任意给定的热聚合循环期间使反应温度在小范围内振荡，优选地在不大于20℃的范围内振荡进行核酸靶序列的依赖于模板的扩增的方法和设备。

背景技术：

注意，以下讨论引用多篇出版物和文献。本文中给出对这些文献的讨论是为了科学原理的更完全的背景，并且不被视为是承认这些出版物是用于确定专利性的现有技术。

在分子生物学中核酸的扩增是最必不可少的技术之一，其在研究、遗传测试、农业和法医学中广为使用。最常见的扩增方法是聚合酶链反应(PCR)，其中，特异性核酸靶序列的优势在溶液中呈指数增加(参见美国专利号4,683,195、4,683,202和4,800,159)。PCR反应采用两种寡核苷酸引物，所述引物杂交待扩增的靶序列的上游(5’)或下游(3’)的DNA双螺旋的相反链。(通常热稳定的)DNA聚合酶用于在5’→3’方向通过添加脱氧核苷三磷酸(dNTPs)使杂交的引物延伸，以便“拷贝”靶序列并且产生双链DNA产物。通过循环反应混合物的温度(典型地摄氏95℃)，DNA的两条链可以在高温分离，这允许它们充当模板以用于进一步的引物结合以及在较低温度(例如55 ℃和60 ℃)聚合。在重复该过程多次后，单个靶序列可以被扩增成数十亿的拷贝。

虽然PCR是装备精良的实验室中的金标扩增方法，但是它相当复杂，需要具有主动加热和冷却加热元件和精确温度控制的昂贵且复杂的热循环装置，并且需要训练有素的技术人员收集有意义的结果。例如，大多数PCR反应需要在至少两个温度（例如95度和57度)之间的快速且精确的循环，这典型地导致使用昂贵和效能低的Peltier发动机(热电冷却机制)和精确的温度控制元件。这样的固有限制使得PCR不适宜于开发具有成本效益的、护理位点(point-of-care)的核酸诊断(这在缺乏支持性实验室基础设施的情况中是有用的)。为了排除一些PCR的大量资源需求，在过去数十年中开发了多种“等温”扩增技术。在这样的反应中，可以在单个温度扩增核酸，不需要昂贵的热循环仪，并且使得它们更适用于低成本诊断设备。实例包括基于核酸序列的扩增(NASBA)，解旋酶介导的扩增，链置换扩增， 环介导的等温扩增(LAMP)等。然而，这些等温扩增方法通常需要60-90分钟的扩增时间(由于缓慢的体外动力学酶促过程所致)和在单一温度点的精确的温度控制以适应极端严格的扩增反应，同样缺少当场诊断应用所需的稳健性和速度。

依赖模板的核酸扩增是基于核酸的分子诊断的基础。在卫生保健、农业中，以及在生物学领域和战争的情境中，急切需要稳健的、低成本的、快速的、护理位点的核酸诊断。然而，与现有的PCR或等温扩增相关的测定化学策略具有显著的工程和稳健性限制，这使得这样的扩增方法昂贵且对于资源有限的情况(其中基于核酸的分子可以最大地影响紧急疾病预防和控制)是不实用的。必须对核酸扩增进行相当大的改进以为缺少专门实验室基础设施的情况提供可负担的且稳健的诊断。

常规PCR依赖高特异性和快速热循环，通常使温度变化多达40℃。这样的扩增方法需要昂贵的仪器以便快速地加热和(尤其地)冷却PCR反应混合物，此外还要精确地保持溶液温度。等温核酸扩增方法，虽然不需要复杂的热循环装置，但是通常是缓慢的(至少60分钟的反应时间)，不可靠的，并且需要精确的温度校准。