[发明专利]基于配对末端随机序列的基因分型

说明书

发明背景

目前使用的大部分标记物发现和基因分型技术主要依赖于两种不同的系统，一种是最初发现的SNP，另一种是之后对大量个体进行的基因分型。这激发本申请人开发一种基于序列的同步标记物发现和检测技术，称为基于随机序列的基因分型（rSBG）。该技术引入了Illumina GAII的高通量测序能力以及(EP534858)的基因组复杂性减低能力。其示例描述在本申请人的WO2007073165中。与各种通常经靶向的其它基因分型技术（即，先选择待检测SNP，并用特异性检测探针靶向）相反，rSBG是随机方法。原则上，当AFLP模板中含有特异性序列时可鉴定品系间存在的所有SNP（通常在使用严格的挖掘过滤（mining filter）后）。其中一个问题是当分析样品来自含有相对大部分重复性序列的基因组时，例如辣椒，鉴定品系间多态性会由于重复性序列的存在而变得更难。

发明内容

本发明人发现可改进在多种样品中评分和基因分型的多态性数目，特别是在使用来自视作高度重复性（即包含许多重复）的基因组样品，使用高通量测序方法来测序限制性片段的两个末端时。通过采用称为配对末端测序的方法，从相同限制性片段中获得两组序列数据（即序列读数），各来自限制性片段的一端。通过组合这些数据组，原来由于例如源自重复片段从而不能相互区分的来自限制性片段的序列数据（序列读数）现在变得可区分了。原因是来自位于上百或甚至上千个核苷酸之外限制性片段另一端的序列读数（通常依赖于所用的限制性酶或片段化方法），能产生独特的组合序列读数（参见图1）。这也能发现、检测来自高度重复性基因组样品的多态性以及进行基因分型。因此本发明方法相比现有技术方法可以最广泛形式应用于更大范围的样品，因为其成功包括了高重复性样品。本发明人发现用该配对末端方法相比单独分析片段各端读数可发现更多SNP并进行基因分型，即，由于在SNP的同步发现和基因分型中使用配对末端测序而获得协同作用。

附图简要说明

图1.基于配对末端随机序列的基因分型示意图。从限制性片段各端形成双标签（ditag）以实现最大的重复序列分离从而用于SNP鉴定。

定义

在以下说明和实施例中，使用了一些术语。为了提供对说明书和权利要求的清楚和一致的理解，包括给予所述术语的范围，提供了下列定义。除非另外定义，本文中使用的所有技术和科学术语具有本发明所属领域普通技术人员通常所理解的同样含义。所有出版物、专利申请、专利和其他文献的公开内容都通过引用全文纳入本文。

本领域技术人员清楚了解本发明方法实施所使用的常规技术。本领域技术人员熟知分子生物学、生物化学、计算化学、细胞培养、重组DNA、生物信息学、基因组学、测序和相关的领域中的常规技术实践，并在例如以下参考文献中描述：Sambrook等，《分子克隆.实验室手册》(Molecular Cloning：A Laboratory Manual)，第二版，纽约冷泉港的冷泉港出版社(Cold Spring Harbor Laboratory Press)，1989；Ausubel等，《新编分子生物学实验指南》（Current Protocols in Molecular Biology），纽约的约翰威利父子公司(John Wiley&Sons)，1987及定期更新；和《酶学方法》系列(the series Methods in Enzymology)，圣地亚哥的学术出版社（Academic Press）。

本文所用的单数形式“一个”、“一种”和“该”包括复数指代形式，除非文中另有明确说明。例如，分离“一个”DNA分子的方法包括分离多个分子（例如，十、百、千、万、十万、百万或更多的分子）。

多态性：多态性指一个群体中存在两种或多种核苷酸序列变体。多态性可以包括一个或多个碱基改变，插入，重复，或缺失。多态性包括例如简单序列重复（SSR）和单核苷酸多态性（SNP），其为DNA序列变异，在单个核苷酸：腺嘌呤(A)、胸腺嘧啶(T)、胞嘧啶(C)或鸟嘌呤(G)改变时发生。通常群中至少1％发生变异被视为SNP。SNP占（例如）所有人类遗传变异的90％，人类基因组中每100至300个碱基即出现。每三个SNP中有两个是腺嘌呤(T)取代胞嘧啶(C)。例如人类和植物的DNA序列变异会影响其如何处理疾病、细菌、病毒、化学试剂、药物等。