[发明专利]一种特异性检测植物乳杆菌的检测方法及其试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术领域，具体涉及特异性检测植物乳杆菌的检测方法及其试剂盒。

背景技术

乳酸菌是一群形态代谢性能和生理学特征不完全相同且能发酵碳水化合物产生乳酸的革兰氏阳性细菌。目前在自然界中已发现的乳酸菌在细菌分类学上可以划分为43个属，包括373个种及亚种，其中绝大多数是厌氧菌或兼性厌氧菌。人类对乳酸菌的分类鉴定和利用已经有久远的历史，并积累了丰富的经验和知识，形成了至今一直沿用的传统分类鉴定方法，包括形态特征、生理生化反应及血清学反应等，这些方法都是基于微生物表面受体的特异性，属于表型分类法。

随着科技的进步，分子生物学方法以其较高的准确性及稳定性等优点逐步替代传统的形态学和生理学检测方法，并已成功介入到益生菌的鉴定领域。16S rDNA序列同源性分析作为细菌系统发育和亲缘关系研究已被普遍接受和广泛应用，但是乳杆菌属内许多种的16S rDNA基因序列具有较高同源性，利用该方法无法使鉴定精确到种。例如，16S rDNA基因序列分析法不能将相近的植物乳杆菌与戊糖乳杆菌区分开。伴随着高通量测序技术的快速发展，大量乳酸菌菌株的基因组图谱已被解析。这些基因组数据可以使我们了解不同益生菌的遗传结构和特点，找出不同菌株的专有特征，从而为不同种乳酸菌的区分和鉴定奠定了基础。

发明内容

因此，本发明所要解决的技术问题是为了克服现有的检测方法难以将植物乳杆菌（Lactobacillus plantarum）鉴定到种的水平的缺陷，而根据现有的已测序的乳酸菌基因组信息并运用生物信息学的方法设计植物乳杆菌的种特异性引物，运用多重PCR的方法与电泳图谱分析来确定菌种特征性片段的存在有无，从而对植物乳杆菌进行特异性快速检测。

本发明提供的技术方案之一是：一种特异性检测植物乳杆菌的方法，其包括如下步骤：

（1）提取待测样品的基因组DNA；

（2）以步骤（1）所提取的基因组DNA为模板，采用核苷酸序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物进行多重PCR反应，以扩增特征性片段；

（3）对步骤（2）得到的扩增产物进行电泳检测并进行结果判断。

本发明中，步骤（1）所述的提取基因组DNA的方法为本领域常规的提取微生物基因组的方法，如碱裂解法或者利用市售的基因组DNA提取试剂盒提取。

本发明中，步骤（2）所述多重PCR反应的反应体系为本领域常规；较佳地，反应体系中包括浓度各为0.2～0.5μmol/L的序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物，0.1～0.3mmol/L的dNTP，1×PCR缓冲液，0.5～1.5mmol/L的Mg2+，0.05～0.15U/μL的Taq DNA聚合酶和1.0～2.0ng/μL的DNA模板；更佳地，所述多重PCR反应的反应体系中包括浓度各为0.4μmol/L的序列分别如SEQ ID NO.1、SEQ ID NO.2、SEQ ID NO.3、SEQ ID NO.4、SEQ ID NO.5和SEQ ID NO.6所示的引物，0.2mmol/L的dNTP，1×PCR缓冲液，1mmol/L的Mg²⁺，0.05U/μL的Taq DNA聚合酶和2.0ng/μL的DNA模板；所述多重PCR反应的反应体系的总体积较佳地为20～50μL，更佳地为25μL。

本发明中，步骤（2）所述多重PCR反应的反应程序为本领域常规，只要能够扩增出植物乳杆菌特异性的基因片段即可；较佳地，所述多重PCR反应的反应程序为：①94～95℃，4～5min；②94～95℃，30～40s；③55～57℃，30～50s；④71～73℃，15～60s；步骤②至④共20～30个循环；⑤71～73℃，8～10min；⑥3～5℃保存；更佳地，所述多重PCR反应的反应程序为：①95℃，5min；②95℃，40s；③55℃，30s；④72℃，30s；步骤②至④共25个循环；⑤72℃，8min；⑥4℃保存。

本发明中，步骤（3）所述的电泳为本领域常规，如琼脂糖凝胶电泳或聚丙烯酰胺凝胶电泳，较佳的是琼脂糖凝胶电泳，更佳的是1～3%的琼脂糖凝胶电泳，最佳的是2%的琼脂糖凝胶电泳。