[发明专利]一种人转铁蛋白乳腺特异性表达载体的构建及应用

说明书

本发明公开了一种利用转基因动物的乳腺生产人转铁蛋白的方法及其表达载体。本发明的方法包括利用含有人转铁蛋白基因表达盒的载体将人转铁蛋白基因表达盒转入哺乳动物基因组中获得转基因动物，从转基因动物乳汁中获得人转铁蛋白，其中，该表达盒从5’到3’依次包括启动子、人转铁蛋白基因和牛生长激素基因终止子，所述启动子是山羊β‑酪蛋白基因，其序列如SEQ ID NO.1所示，所述人转铁蛋白基因是序列表中SEQ ID NO.2所示，所述的载体是真核表达载体pcDNA3.1，所述的哺乳动物不包括人。本发明的方法，在动物的乳汁中人转铁蛋白的浓度至少可达到5g/L，比现有的方法提高了160倍以上，具有巨大的商业利用价值。

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种人转铁蛋白乳腺特异性表达载体的构建及应用。

背景技术

人转铁蛋白（Human transferrin,hTF）是一种非血红素的铁结合糖蛋白，能使得铁离子与之紧密结合，并将其有选择地释放到特定部位与靶细胞上的特异受体结合以行使生理功能^[1]，是先天性无转铁蛋白血症等多种疾病治疗必备的药物，同时它还参与呼吸、细胞增殖和免疫系统的调节^[2]。最近几年的研究发现转铁蛋白还是胚胎干细胞和神经干细胞生长非常重要的一种调节因子。

目前人转铁蛋白主要从血浆中提取并纯化，不仅步骤繁琐、效率低下，而且原料容易受HIV、HBV等病毒的感染，给制备和使用带来潜在的风险。转基因动物乳腺生物反应器是近些年发展起来的一项生物制药新方法，具有广泛的应用前景。2006年，美国GTC生物制药公司通过转基因动物乳汁生产的重组药物人抗凝血酶III已率先上市，另外尚有多种重组药物蛋白正处于各期临床试验中。因此采用转基因动物乳腺生物反应器来生产诸如人转铁蛋白这样重要的生物蛋白具有很好市场价值。

经过二十余年的研究，人们已经在转基因动物乳腺生物反应器研制方面积累了一定的经验。研究发现乳蛋白（即可在乳汁中表达的蛋白）在转基因动物乳汁中的表达水平明显高于非乳蛋白，而这些蛋白由于用量较大，只有当其表达水平超过1g/L时，该转基因动物才有商业利用价值。

但是，到目前为止，根据已有文献报道尚无可在哺乳动物乳汁中高效表达人转铁蛋白的载体，有文献通过兔转铁蛋白基因启动子和增强子指导人转铁蛋白，获得的转基因小鼠乳汁中hTF表达水平亦不超过0.7g/L，尚无法满足乳腺生物反应器的要求。

发明内容

本发明要解决的技术问题是针对现有的利用转基因动物的乳腺生产人转铁蛋白的方法中人转铁蛋白的表达水平低下的不足，提供一种人转铁蛋白的表达水平达5g/L以上的动物乳腺生产人转铁蛋白的方法以及其中所用到的表达载体。

为此，本发明解决上述问题的技术方案之一是：一种利用转基因动物的乳腺组织生产人转铁蛋白的方法，包括利用含有人转铁蛋白基因表达盒的载体将人转铁蛋白基因表达盒转入哺乳动物基因组中获得转基因动物，使该转基因动物分泌乳汁，从乳汁中获得人转铁蛋白，其中，所述的人转铁蛋白基因表达盒从5’到3’依次包括启动子、人转铁蛋白基因和终止子，其中所述的启动子是山羊β-酪蛋白基因启动子，其长度为6.5Kb，序列如SEQ IDNO.1所示，其中包括启动子近端成分、远端长达4Kb的上游调控区和山羊β-酪蛋白第一内含子，第一外显子和第二外显子。

本发明中，所述的人转铁蛋白基因如常规，较佳的是人转铁蛋白的编码序列，更佳的是序列表中SEQ ID NO.2所示。

本发明中，所述的终止子是本领域常规。本发明中较佳的是牛生长激素基因的终止子，更佳的其序列如SEQ ID NO.3所示。

本发明中，所述的含有人转铁蛋白基因表达盒的载体可以是本领域的各种能够转染哺乳动物细胞的表达载体，比如慢病毒载体、腺病毒载体等，较佳的是常规的真核表达载体，优选质粒pcDNA3.1。