[发明专利]采用环介导等温扩增技术检测猕猴桃溃疡病菌的方法

说明书

技术领域

本发明属于植物细菌学技术领域，特别是涉及一种采采用环介导等温扩增技术检测猕猴桃溃疡病菌的方法。 

背景技术

我国是猕猴桃的主要产区，其种植面积和产量均居世界之首。陕西省的猕猴桃产量更是位居全国之首。猕猴桃溃疡病在我国猕猴桃的各大产区都有不同程度的发生，严重威胁猕猴桃的生产，被列为全国森林植物检疫对象。此病来势凶猛，是一种毁灭性病害，发生时不仅减低产量，而且导致果皮变厚，果味变酸，果实变小，果形不一，品质下降，商品价值降低，造成严重的经济损失。 

猕猴桃溃疡病的危害严重及防治困难，一直是猕猴桃生产和理论上的一个重要问题。目前很难找到一种有效的防治药物。目前普遍采用的检测猕猴桃溃疡病菌的方法主要有血清学方法、电镜技术和分子生物学检测等。但上述方法均存在不同的缺点，例如，所需试验周期较长、操作繁琐、灵敏度不高、特异性不强、准确性较低、易受检测材料限制等。 

环介导等温核酸扩增(Loop-mediated i sothermalmplification，LAMP)技术是由T.Notomi发明的一种新型核酸扩增技术，该技术依赖四条特异引物和一种具有链置换特性的DNA聚合酶，在等温条件下快速、高效、高特异、高灵敏地扩增靶序列(Notomietal，2000)。迄今已建立了针对多种病原性细菌、病毒、真菌、寄生虫等的LAMP检测方法，在耐药性基因检测、家畜早期胚胎性别判定等方面也有相关报道。该方法应用范围广泛，适于基层实验室进行快速检测。本发明根据猕猴桃溃疡病菌16S基因设计了LAMP引物，采用环介导等温扩增技术(LAMP)建立了一种快速、灵敏、高度特异的检测猕猴桃溃疡病菌的方 法。为猕猴桃溃疡病的快速检测提供了新的手段。 

发明内容

为解决上述技术问题，本发明提供了一种采用环介导等温扩增技术检测猕猴桃溃疡病菌的方法，其中该方法包括猕猴桃溃疡病菌DNA的提取，LAMP反应和实时浊度检测，从分子水平对猕猴桃溃疡病菌进行筛查和检测，所述LAMP反应采用如下三对引物中的任意一对引物组： 

外引物(F3和B3)： 

SEQID NO.1：5’-CCGATTTTGGGTCTGTAGCT-3’； 

SEQID NO.2：5’-GTAAGTGGTGGAGCCAAGC-3’； 

内引物(FIP和BIP)： 

SEQID NO.3：5’-CGCGCTCTGACCAACTTCACCACCCCTGATAAGGGTGAGG-3’；SEQID NO.4：5’-TACGACACCCGGATACGGGGATCGAACCGCTGACCTCC-3’；环引物(LF和LB)： 

SEQID NO.5：5’-GGCAGATTCGAACTGCCGA-3’； 

SEQID NO.6：5’-CCATAGCTCAGCTGGGAGA-3’。 

优选地，上述方法中，所述LAMP反应采用上述全部3对引物组，即六条引物，SEQID NO.1-6。 

在一个具体的实施方案中，本发明所述的采用环介导等温扩增技术检测猕猴桃溃疡病菌的方法，其包括如下步骤： 

1)溃疡病菌总DNA的提取： 

提取猕猴桃溃疡病菌的总DNA； 

2)LAMP反应： 

使用外引物SEQ ID NO.1-2、内引物SEQ ID NO.3-4和环引物SEQ IDNO.5-6对溃疡病菌总DNA进行LAMP反应，得到扩增产物； 

3)浊度检测： 

对扩增产物进行浊度观察，确定猕猴桃是否感染所述溃疡病菌。 

在一个具体的实施方案中，本发明所述的采用环介导等温扩增技术检测猕猴桃溃疡病菌的方法，其包括如下步骤： 

1)溃疡病菌的培养： 

猕猴桃溃疡病菌在液体LB培养基中，26℃条件下培养12小时，取0.5微升该液体直接用于检测； 

2)LAMP反应： 

使用外引物SEQ ID NO.1-2、内引物SEQ ID NO.3-4和环引物SEQ IDNO.5-6对溃疡病菌的DNA进行LAMP反应，得到扩增产物； 

3)浊度检测： 

对扩增产物进行浊度观察，确定猕猴桃是否感染所述溃疡病菌。 

在一个具体的实施方案中，在本发明上述的方法中，LAMP反应中使用的引物浓度比例为：外引物SEQ ID NO.1-2∶内引物SEQ ID NO.3-4∶环引物SEQ ID NO.5-6＝1∶8∶4；