[发明专利]一种烟曲霉蛋白单克隆抗体及其制备方法和用途

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程、细胞工程和曲霉病的免疫诊断领域，涉及一种烟曲霉蛋白单克隆抗体及其制备方法和用途。

背景技术

近期研究证明，以测定真菌抗原、抗体和循环代谢产物为基础的血清学诊断方法潜力较大^[1～4]。曲霉在体内发生侵袭性感染时，由孢子状态延伸生长成菌丝，此时向体液中释放菌丝蛋白，并刺激机体产生抗体。鉴于曲霉感染的这个特征，一般认为，血循环中抗原或特异抗体水平上升，预示着菌丝体延伸和/或曲霉感染的发展。由于曲霉蛋白质成分复杂，而且基础疾病、前期用药不同的病人其机体处于不同免疫状态，导致体内曲霉抗原、抗体种类和量也有差别^[5～8]。因此，作为实验室诊断用的目标抗原和抗体，应该选择在不同免疫状态的病人罹患侵袭性曲霉病时，在其体内优势大量表达、并能够强烈刺激人体产生抗体的曲霉蛋白质抗原组分。

我们用免疫蛋白质组学法筛选烟曲霉免疫优势抗原时^[9]，发现了一个与确诊侵袭性曲霉病（IA）血清发生强免疫反应的新的烟曲霉蛋白，即硫氧还蛋白还原酶GliT（TR），分子量约36.2KDa。用SignalP软件预测结果显示，TR带有信号肽（signalP probability，0.808）；WoLF PSORT软件预测结果显示TR为胞外蛋白（Query Protein WoLFPSORT prediction：extr，12.0;cyto，6.5；cyto_nucl，4.0；mito，3.0；pero，2.0）；用BLAST程序进行同源性分析显示，TR与人源性蛋白质没有同源性，与其他真菌蛋白质的同源性也很低，如与白念珠菌蛋白质的同源性为25%，热带念珠菌25%，光滑念珠菌24%，季也蒙念珠菌27%，酿酒酵母菌24%，马尔尼菲青霉27%^[10]，是一个理想的诊断标志物。TR可以作为烟曲霉的特异性抗原用于曲霉病尤其是IA的血清学诊断。

为此，我们克隆表达了该蛋白，并建立了ELISA法来检测血清中的anti-TR水平，结果显示，烟曲霉孢子感染一周后即出现anti-TR抗体阳性，且抗体滴度快速上升。检测血清anti-TR抗体在免疫功能相对正常的非粒缺IPA患者中诊断的敏感性和特异性为80.9%和96%，明显优于现有试剂盒GM的检测（43.5%，p＜0.05）^[10]。而联合检测anti-TR抗体和抗原TR，可明显提高检测的敏感性。

因此，制备出特异性识别烟曲霉TR蛋白、且与之高亲和力结合的单克隆抗体，用于配制诊断曲霉病的试剂组合物，是目前生物医学领域亟待解决的问题。

参考文献：

1.Pfeiffer CD,Fine JP,Safdar N.Diagnosis of invasive aspergillosis using agalactomannan assay:a meta-analysis.Clin Infect Dis.2006,42(10):1417-1427

2.Khan ZU,Ahmad S,Theyyathel AM.Detection of Aspergillus fumigatus-specific DNA,(1–3)-b-D-glucan and galactomannan in serum and bronchoalveolar lavage specimensof experimentally infected rats.Mycoses.2008,51(2):129-135

3.Einsele H,Loeffler J.Contribution of new diagnostic approaches to antifungaltreatment plans in high-risk haematology patients.Clin Microbiol Infect.2008,14(S4):37-45.

4.李芳秋，周万青，史利宁，等.烟曲霉分泌蛋白抗体的ELISA检测及诊断价值评估.临床检验杂志，2010，28（2）：107-109

5.Sarfati J,Monod M,Recco P,et al.Recombinant antigens as diagnostic markersfor aspergillosis.Diagnostic microbiology and infectious disease2006,55(4):279-291.