[发明专利]大豆种子总蛋白质的提取方法及其专用试剂

说明书

技术领域

本发明涉及一种大豆种子总蛋白质的提取方法及其专用试剂。

背景技术

大豆是我国和世界上重要的经济作物，其种子油是人类与动物营养以及食品加工业植物食用油的重要来源，大豆油用量占全世界食用油的31%。同时，大豆种子也包含丰富的蛋白，是世界上植物蛋白的主要来源。鉴定大豆种子表达全蛋白，对于进一步解析大豆种子中蛋白和油积累机制有重要的参考作用。

蛋白质是基因表达的产物，也是许多生理功能的主要执行者和体现者，随着功能基因组学的兴起，蛋白质组学（Proteomics）已成为生命科学研究的重点之一。蛋白质组学研究的宗旨是对组织或细胞的所有蛋白质（至少是大部分）进行分离与鉴定。通过蛋白质组的分析可以检测生命活动变化过程中蛋白表达量及翻译后修饰等变化，从而阐明其生物学功能的分子机制。蛋白样品的提取和制备是进行蛋白质组学分析的关键步骤，蛋白样品的纯度和再溶性直接影响双向电泳分离结果的清晰度和重复性。经典双向电泳（2-DE）的分离方法与程序主要适用于模式植物拟南芥与重要经济作物水稻的全蛋白分析。Toorchi等（J.Proteome Res.,2008,7:3035-3041）用三种不同的蛋白提取方法和两种裂解液对水稻和大豆的各种组织进行蛋白质组学分析，结果发现：大豆蛋白质组凝胶图谱的蛋白点数比水稻的少；蛋白提取方法与裂解液配方的不同严重影响大豆蛋白的溶解与分离；大豆和水稻对所有裂解液配方的敏感性不同。由此可见，探索、优化大豆各种组织器官蛋白样品制备的方法与程序是其蛋白质组学发展的前提与基础。

大豆种子含有大约36%蛋白质、30%碳水化合物、20%油脂、9%粗纤维和5%灰分。另外，在大豆种子中还存在大量的次生代谢产物。大豆次生代谢产物、脂质、大量碳水化合物及酚类混合物等干扰物质的广泛存在不仅妨碍高质量蛋白样品的提取，也影响2-DE胶的分离效果，是导致条纹和污渍产生、影响高清晰度蛋白点数目的主要原因。高纯度大豆全蛋白样品的获得是大豆蛋白质组成功的关键。

目前，在关于成熟大豆种子蛋白质组学研究的相关报道中，Mooney等(Phytochemistry 2004,65,1733-1744)和Barbosa等(Planta 1988,175,485-492)分别鉴定了44个和192个蛋白点；另两个研究(Natarajan,et al.,Anal.Biochem.2009,394,259-268;Krishnan,et al.,Proteomics 2009,9,3174-88)通过去掉成熟大豆种子的高丰度储藏蛋白，分别鉴定到107个和196个蛋白点。但是大豆成熟种子中的蛋白远不止这些，进一步鉴定到更多的蛋白将会为大豆种子发育、成熟以及萌发等提供更多的参考资料。

发明内容

本发明的一个目的是提供一种提取大豆种子总蛋白质的方法，包括如下步骤：

1）取大豆种子和溶液S1按1g:3ml的比例混合提取蛋白质，收集所有物质获得混合物甲；

2）向步骤1）的所述混合物甲中加入与步骤1）所述溶液S1体积相同的溶液S2再提取蛋白质，收集所有物质获得混合物乙；

3）将步骤2）所述混合物乙离心，取上清液用三氯乙酸沉淀，获得所述大豆种子总蛋白质；

所述溶液S1的溶剂为水，溶质为蔗糖、Tris-HCl、乙二醇二乙醚二胺四乙酸（EGTA）、苯甲基磺酰氟（PMSF）和β-巯基乙醇，所述蔗糖、Tris-HCl、EGTA、PMSF和β-巯基乙醇在所述溶液S1中的浓度分别为170g/L、40mmol/L、20mmol/L、2mmol/L和5%（体积百分含量）；所述溶液S1的pH值为7.5；

所述溶液S2的溶剂为水，溶质为蔗糖、Tris-HCl、EGTA、PMSF和聚乙二醇辛基苯基醚(TritonX-100)，所述蔗糖、Tris-HCl、EGTA、PMSF和TritonX-10在所述溶液S2中的浓度分别为170g/L、40mmol/L、20mmol/L、2mmol/L和4%（体积百分含量）；所述溶液S2的pH值为7.5。

在上述方法中，步骤1）中所述提取包括将所述大豆种子和所述溶液S1进行研磨的步骤，该研磨的时间为8—12分钟，如10分钟；

和/或，步骤2）中所述提取包括将所述混合物甲和所述溶液S2进行研磨的步骤，该研磨的时间为8—12分钟，如10分钟；

所述研磨的温度为0℃；

在上述方法中，步骤3）中所述离心的相对离心力可为10000g，离心时间为10分钟；所述离心的温度为4℃。