[发明专利]大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及微生物技术领域，特别是涉及一种大肠杆菌感受态细胞的制备方法。

背景技术

在自然条件下，很多质粒都可通过细菌接合作用转移到新的宿主内，但人工构建的质粒载体，缺乏此种转移所必须的mob基因，因此不能自行完成从一个细胞到另一个细胞的接合转移。如需将质粒载体转移进受体细菌，需诱导受体细菌产生一种短暂的感受态以摄取外援DNA。

转化是将外源DNA分子引入受体细胞，使之获得新的遗传性状的一种手段，它是微生物遗传、分子遗传、基因工程等研究领域的基本实验技术,这是现代分子生物学最基本的操作技术。受体细胞经过一些特殊方法的处理后，细胞膜的通透性发生了暂时性的改变，成为能允许外源DNA分子进入的感受态细胞。转化效率直接影响前后实验的进展和工作效率，而感受态细胞的状态是影响转化效率最直接、关键的因素之一。

通常实验室自己制备感受态细胞，常用的制备方法包括CaCl₂法和Inoue法。CaCl₂法简便易行，但制备的感受态细胞转化效率较低，不能满足常规载体构建的需要；Inoue法虽然感受态细胞的转化效率较高，但细菌的培养条件是18℃，需要低温摇床，振荡19h～50h，摇菌的时间较长，并且过程相对繁琐。

发明内容

基于此，有必要提供一种转化效率高、操作简单实用的大肠杆菌感受态细胞的制备方法

一种大肠杆菌感受态细胞的制备方法，包括如下步骤：

步骤一、将-80℃冷藏的大肠杆菌融化后画线接种于LB平板上，37℃培养过夜后挑取单菌落于5mL的加入了MgCl₂溶液的SOB培养基中，37℃振荡培养12h～16h；

步骤二、取500μL步骤一中得到的培养液接种于50mL的加入了MgCl₂溶液的所述SOB培养基中，37℃培养约3h，使培养液的吸光值OD(A₆₀₀)为0.4～0.6；

步骤三、将步骤二中得到的菌液转移至50mL无菌离心管，冰浴10min，接着4℃下4000rpm离心10min；

步骤四、将步骤三得到的离心液去上清，将沉淀重悬于15mL预冷的TB转化缓冲液中，在冰上放置10min，接着4℃下4000rpm离心10min；

步骤五、将步骤四得到离心液去上清，将沉淀重悬于4mL预冷的所述TB转化缓冲液中，加入DMSO并轻摇混匀，使DMSO的体积浓度为7%；

步骤六、将步骤五得到的悬液在冰上放置10min后分装到预冷的无菌EP管中，得到所述大肠杆菌感受态细胞。

在一个实施例中，所述SOB培养基的配制过程如下：

将2g胰蛋白胨、0.5g酵母膏、0.05g NaCl和0.0186g KCl溶解在双蒸水中至100mL，调节pH为7.0后灭菌，得到所述SOB培养基。

在一个实施例中，每20mL的所述TB转化缓冲液由如下成分组成：

12.5mL的双蒸水、4mL的1mol/L的KCl、2.4mL的0.45mol/L的MnCl₂、0.5mol/L的CaCl₂0.6mL和0.5mL的0.5mol/L的K-MES缓冲液。

在一个实施例中，所述0.5mol/L的K-MES缓冲液的配制过程如下：

称取9.76g MES完全溶解于80mL的双蒸水中，用1mol/L的KOH调节pH为6.3，补加双蒸水到100mL，过滤灭菌后保存于-20℃，得到所述0.5mol/L的K-MES缓冲液。

在一个实施例中，步骤一中和步骤二中，每毫升的SOB培养基中加入2mol/L的MgCl₂溶液10μL。

在一个实施例中，所述冷藏的大肠杆菌保存于LB和DMSO的混合液中，DMSO的体积浓度为70%。

在一个实施例中，步骤一中，所述37℃振荡的操作中，转速为220rpm。

在一个实施例中，步骤四和步骤五中，所述TB转化缓冲液为新鲜配制的。

这种大肠杆菌感受态细胞的制备方法不需要低温培养，在普通37℃摇床中培养即可，没有设备要求的限制，既适用于一般实验室的制备，也可用于商业化生产。与传统的感受态细胞制备方法相比，转化效率高且操作简单实用。

附图说明

图1为一实施方式的大肠杆菌感受态细胞的制备方法的流程图。

具体实施方式