[发明专利]大肠杆菌高效感受态细胞的制备方法

权利要求书

1.一种大肠杆菌感受态细胞的制备方法，其特征在于，包括如下步骤：

步骤一、将-80℃冷藏的大肠杆菌融化后画线接种于LB平板上，37℃培养过夜后挑取单菌落于5mL的加入了MgCl₂溶液的SOB培养基中，37℃振荡培养12h～16h；

步骤二、取500μL步骤一中得到的培养液接种于50mL的加入了MgCl₂溶液的所述SOB培养基中，37℃培养约3h，使培养液的吸光值OD(A₆₀₀)为0.4～0.6；

步骤三、将步骤二中得到的菌液转移至50mL无菌离心管，冰浴10min，接着4℃下4000rpm离心10min；

步骤四、将步骤三得到的离心液去上清，将沉淀重悬于15mL预冷的TB转化缓冲液中，在冰上放置10min，接着4℃下4000rpm离心10min；

步骤五、将步骤四得到离心液去上清，将沉淀重悬于4mL预冷的所述TB转化缓冲液中，加入DMSO并轻摇混匀，使DMSO的体积浓度为7%；

步骤六、将步骤五得到的悬液在冰上放置10min后分装到预冷的无菌EP管中，得到所述大肠杆菌感受态细胞。

2.根据权利要求1所述的大肠杆菌感受态细胞的制备方法，其特征在于，所述SOB培养基的配制过程如下：

将2g胰蛋白胨、0.5g酵母膏、0.05g NaCl和0.0186g KCl溶解在双蒸水中至100mL，调节pH为7.0后灭菌，得到所述SOB培养基。

3.根据权利要求1所述的大肠杆菌感受态细胞的制备方法，其特征在于，每20mL的所述TB转化缓冲液由如下成分组成：

12.5mL的双蒸水、4mL的1mol/L的KCl、2.4mL的0.45mol/L的MnCl₂、0.5mol/L的CaCl₂ 0.6mL和0.5mL的0.5mol/L的K-MES缓冲液。

4.根据权利要求3所述的大肠杆菌感受态细胞的制备方法，其特征在于，所述0.5mol/L的K-MES缓冲液的配制过程如下：

称取9.76g MES完全溶解于80mL的双蒸水中，用1mol/L的KOH调节pH为6.3，补加双蒸水到100mL，过滤灭菌后保存于-20℃，得到所述0.5mol/L的K-MES缓冲液。

5.根据权利要求1所述的大肠杆菌感受态细胞的制备方法，其特征在于，步骤一中和步骤二中，每毫升的SOB培养基中加入2mol/L的MgCl₂溶液10μL。

6.根据权利要求1所述的大肠杆菌感受态细胞的制备方法，其特征在于，所述冷藏的大肠杆菌保存于LB和DMSO的混合液中，DMSO的体积浓度为70%。

7.根据权利要求1所述的大肠杆菌感受态细胞的制备方法，其特征在于，步骤一中，所述37℃振荡的操作中，转速为220rpm。

8.根据权利要求1所述的大肠杆菌感受态细胞的制备方法，其特征在于，步骤四和步骤五中，所述TB转化缓冲液为新鲜配制的。