[发明专利]一种提取质粒DNA的试剂和方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学领域，尤其涉及一种提取质粒DNA的试剂和方法。

背景技术

质粒DNA是基因工程常用的载体，可以携带外源基因进入细菌、动物细胞或植物体内进行扩增与表达，质粒DNA的提取和纯化是分子生物学研究领域中应用最广泛和最基本的技术，质粒提取的效率和质量对于后续实验(酶切、PCR扩增和测序等)的成功与否有着直接的关系。目前在国内外，很多生物试剂公司都研制了与提取质粒技术相关的试剂盒，如普洛麦格(promega)、碧云天、生工等。该类试剂盒多以纯化柱为主，成本高，价格昂贵，试剂繁杂且耗时较长。若以改良的碱裂解、酚—氯仿抽提方法提取质粒，获得的质粒DNA产量低，质量不高，不能满足下游的酶切和测序的要求，同时多种试剂混合应用，无疑加大了实验的工作量，使得实验时间显著延长，影响生物学实验操作和实验结果。

发明内容

本发明解决了以上不足，提供了一种提取质粒DNA的试剂和方法，本发明所用提取质粒的试剂成本低，提取质粒DNA的方法操作简单，且本发明所述的试剂和方法提取出的质粒产量高、纯度高，本发明具有快速、高效、高质且成本低的优点。

为实现上述发明目的，本发明采用下述技术方案：

一种提取质粒DNA的试剂，其特征在于它包括菌体裂解试剂、蛋白抽提试剂、质粒DNA沉淀试剂和质粒DNA溶解试剂；所述菌体裂解试剂的组分为：10mM Tris-HCl、1mM EDTA、150mM氯化钠和5mg/ml溶菌酶，以超纯水为溶剂，所述Tris-HCl的PH值为7.5-7.8；所述蛋白质抽提试剂的组分为酚和氯仿的体积比为1∶1的混合物；所述质粒DNA沉淀试剂的组分是PH为7.5的5.5M醋酸钠溶液和无水乙醇，其中醋酸钠溶液和无水乙醇体积比为1∶4；所述质粒DNA溶解试剂的组分为含有0.15mg/ml RNase的超纯水。

本发明还提供了一种提取质粒DNA的方法，它包括以下步骤：

(1)摇菌扩增质粒；将携带质粒的大肠杆菌接种于LB固体培养基中，挑选单克隆菌落接种于LB液体培养基扩增培养，置于在30-37.5℃恒温摇床上培养，摇床转速为200-250转/分钟；

(2)取培养12-15小时OD₆₀₀达到0.5～0.6之间的生长状态良好的细菌菌液1.5ml于1.5ml离心管，室温下以12000g离心30秒，弃上清；

(3)沉淀中加入100μl所述菌体裂解试剂，充分振荡混匀；

(4)加入100μl所述蛋白抽提试剂，置于涡旋振荡仪上混匀5秒钟；

(5)室温下以12000g离心5分钟以释放质粒DNA；

(6)收集上清，切勿触动蛋白质界面；

(7)加入20μl质粒DNA沉淀试剂和200μl的无水乙醇，颠倒混匀；

(8)室温下以12000g离心1分钟以沉淀质粒DNA；

(9)弃上清，并干燥质粒DNA；

(10)用50μl质粒DNA溶解试剂溶解质粒DNA，-20℃保存备用。

与现有产品相比，本发明的优点是：本发明的所用试剂采用溶菌酶溶解细菌，通过酚-氯仿一步法去除蛋白质和RNA。用本发明所述提取质粒的方法提取质粒的操作时间短，提取一种质粒的时间只需8分钟；本发明所用提取质粒的试剂组成简单，均为常见实验试剂，来源广泛且价格低，各组分均可以采用国产分析纯就可以提取到高产量和纯度的质粒，大大降低了费用；获得的质粒DNA产量高，纯度好，无蛋白和RNA的污染，满足分子生物学相关实验要求，提取到的质粒DNA可以直接用于下游的酶切、连接、测序、原核转化和真核转染等实验，大大方便了生物实验操作，节省了实验时间，提高了实验效率。

附图说明：

图1，不同方法产品所提取的质粒DNA图谱

(M为标准分子量，1、2为promega纯化试剂盒，3、4为使用碧云天柱式纯化盒所提取的相应质粒DNA，5、6为使用本发明方法所提取的质粒DNA)

具体实施方式

下面结合附图和具体实施方式对本发明的技术方案作进一步详细的说明。

实施例1

本发明所述的提取质粒DNA的试剂包括四种试剂，分别为菌体裂解试剂R1；蛋白抽提试剂R2；质粒DNA沉淀试剂R3；质粒DNA溶解试剂R4。

所述菌体裂解试剂R1：

组分：10mM Tris-HCl(pH 7.8)；

1mM  EDTA；

150mM氯化钠；

5mg/ml溶菌酶。

按如下方法配制100ml的试剂R1：