[发明专利]黄曲霉毒素B1的抗原模拟表位及其应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及黄曲霉毒素B₁抗原模拟表位及其应用。

背景技术

黄曲霉毒素B₁(aflatoxin B₁，AFB₁)是主要由黄曲霉和寄生曲霉产生的次级代谢产物，广泛存在于花生、棉籽、玉米、小麦和稻米等农作物中。AFB₁对人及动物肝脏组织有破坏作用，严重时可导致肝癌甚至死亡，1993年被WHO的癌症研究机构划定为I类致癌物。因此，食品中AFB₁的检测对于人类健康意义重大。

目前，检测食品中AFB₁的方法主要有高效液相色谱、气相色谱、薄层色谱及免疫学检测等方法，免疫学检测方法以其灵敏度高、检测方便、成本低廉等优势在AFB₁的检测中得到了广泛的应用。然而，在建立免疫学检测方法的过程中，必须使用AFB₁标准品为原料来制备竞争抗原或者固相包被抗原，AFB₁不仅价格昂贵而且具有极强的致癌性，对检测人员的健康和环境造成极大的威胁，从而在一定程度上制约了免疫学检测方法的应用和推广。有鉴于此，人们开始采用抗独特型抗体及抗原模拟表位技术来实现有害小分子物质标准品的替代，并取得了一定的进展。噬菌体展示肽库技术的主要特点是可有效地筛选出与目标靶体特异结合的噬菌体展示多肽，该技术在探索受体与配体之间相互作用结合位点、寻求高亲和力生物活性的配体分子、探索未知蛋白质空间结构表位、新型疫苗的研制等方面应用广泛。

本发明通过用噬菌体展示肽库技术，从肽库中筛选出能与靶分子（抗AFB₁单克隆抗体）特异性结合的多肽（抗原模拟表位），该抗原模拟表位具有与天然AFB₁分子相似的免疫反应特性，通过获得的AFB₁抗原模拟表位，以代替价格昂贵且毒性强的AFB₁标准品，并作为竞争抗原或固相包被抗原应用于AFB₁的免疫学检测。

发明内容

本发明以抗AFB₁单克隆抗体为靶分子，将靶分子固相包被于酶标板上，分别投入噬菌体随机展示环七、十二肽库，分别进行亲和淘选，获得了两种AFB₁的抗原模拟表位（环七肽及十二肽各1种）。它们的氨基酸序列如下：

AFB₁抗原模拟表位1：从噬菌体随机环七肽库中筛选的AFB₁抗原模拟表位（多肽），其氨基酸序列为：CDPRKHIHC。

AFB₁抗原模拟表位2：从噬菌体随机十二肽库中筛选的AFB₁抗原模拟表位（多肽），其氨基酸序列为：VPYSPHYFERMI。

本发明还涉及编码上述抗原模拟表位氨基酸序列的核苷酸序列，优选为GAT CCG CGT AAG CAT ATT CAT或GTT CCG TAT TCG CCT CAT TAT TTT GAG CGT ATG ATT。

上述抗原模拟表位（多肽）结构中，大写英文字母分别代表二十一种已知天然L-型氨基酸残基或其D-型异构体的一种，即C代表半胱氨酸残基，D代表天冬氨酸残基，P代表脯氨酸残基，R代表精氨酸残基，K代表赖氨酸残基，H代表组氨酸残基，I代表异亮氨酸残基，V代表缬氨酸残基，Y代表酪氨酸残基，S代表丝氨酸残基，F代表苯丙氨酸残基，E代表谷氨酸残基，M代表甲硫氨酸残基。模拟表位1的N末端和C末端的两个半胱氨酸残基形成分子内二硫键，为环状结构。

本发明提及的AFB₁抗原模拟表位（多肽）可通过噬菌体扩增、化学合成或基因工程重组表达

的方式进行大量制备。噬菌体扩增是指将展示有AFB₁抗原模拟表位（多肽）的噬菌体，通过生物扩增的方式，大量繁殖生产展示有AFB₁抗原模拟表位（多肽）的噬菌体粒子。化学合成是指依据公布的模拟表位1、模拟表位2的氨基酸序列，通过化学合成多肽的方式进行多肽合成。基因工程重组表达的方式是指将编码模拟表位1或模拟表位2的基因，通过克隆至表达载体，以多肽-融合蛋白的形式进行AFB₁抗原模拟表位的大量制备。

本发明还涉及所述黄曲霉素B₁抗原模拟表位在免疫学检测分析中的应用。免疫学检测的类型包括酶联免疫吸附检测、胶体金免疫层析、免疫斑点杂交等基于抗原-抗体特异性反应的免疫学分析检测类型。