[发明专利]稳定的NAD/NADH衍生物

说明书

本申请是申请号为200680027359.1的中国专利申请的分案申请，要求2005年7月28日的优先权。

技术领域

本发明涉及稳定的烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD/NADH)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP/NADPH)衍生物、这些衍生物的酶配合物和它们在生物化学检测方法和试剂盒方面的用途。

背景技术

生物化学分析学的测量系统是临床相关分析方法的重要部分。这主要涉及直接或者间接在酶的辅助下进行测定的分析物的测定，例如代谢物或者底物。该分析物在酶-辅酶配合物的辅助下进行转化，和随后进行定量测定。在该方法中，预测定的分析物与适宜的酶和辅酶接触，其中酶主要以催化量使用。通过酶反应，辅酶得到改变，例如被氧化或者还原。该方法可以直接或者通过介体得到电化学或者光度检测。标定提供了意欲进行测定的分析物的测量值和浓度之间的直接相关性。

辅酶是共价或者非共价与酶连接的有机分子，并且通过分析物的转化得到改变。辅酶的突出实例为烟酰胺腺嘌呤二核苷酸(NAD)或烟酰胺腺嘌呤二核苷酸磷酸(NADP)，通过还原它们分别形成NADH或NADPH。

现有技术已知的测量系统的特征在于在时间上有限的贮存期限，和为了获得该储存期限，对环境有特殊要求，比如，冷却或者干燥储存。由此，由不正确的、未注意的、不完善的存储导致的错误结果对于某些应用形式可能存在，例如，在其中最终用户自身进行测试的情形中，比如葡萄糖自我监控。特别是，由于开放初始包装过长时间导致干燥剂耗尽，会导致测量误差，该测量误差在一些系统中，消费者几乎不能辨认。

可以用于升高生物化学测量系统稳定性的已知测量是使用稳定的酶，例如，使用得自于喜温有机体的酶。还可以通过化学修饰使酶稳定，例如交联或者诱变。此外，还可以将酶稳定剂(比如海藻糖、聚乙烯吡咯烷酮和血清清蛋白)加入或者将酶包装入聚合物网络中，例如通过光致聚合作用。

还意图通过使用稳定的介体改良生物化学测量系统的储存期限。由此，通过使用具有最低可能氧化还原电势的介体，测试的特异性会升高和反应期间的干扰会被消除。然而，酶/辅酶配合物的氧化还原电势构成了介体的氧化还原电势的下限。如果降低到该下限之下，与介体的该反应将被延迟，或者甚至被阻止。

另外地，还可以使用无介体的生物化学测量系统，其中，对辅酶(比如辅酶NADH)直接进行检测。然而，所述测量系统的缺点是比如NAD和NADP的辅酶是不稳定的。

NAD和NADP是碱不稳定(basenlabile)的分子，其降解途径描述在文献(N.J.Oppenheimer in The Pyridine Nucleotide Coenzyms AcademicPress，New York，London 1982，J.Everese，B.Anderson，K.You，Editors，Chapter 3，第56-65页)中。ADP-核糖基本上在NAD或者NADP通过裂解核糖和吡啶单元之间的糖基键接的降解期间形成。然而，还原形式的NADH和NADPH对酸不稳定：例如，差向异构化是已知的降解途径。在上述两种情形中，NAD/NADP和NADH/NADPH的不稳定性是由于核糖和吡啶单元之间的糖基键的不稳定性。但是，即使在并不剧烈的条件下(比如在含水溶液中)，辅酶NAD或NADP仅仅通过环境湿度进行水解。当测量分析物时，该不稳定性会导致不精确。

一系列NAD/NADP衍生物描述在，例如，B.M.Anderson in thePyridine Nucleotide Coenzymes，Academic Press New York，London 1982，J.Everese，B.Anderson，K.You，Editors，Chapter 4中。然而，酶对这些衍生物中的大多数接受并不良好。为此，先前用于诊断性测试的唯一衍生物是3-乙酰基吡啶腺嘌呤二核苷酸(乙酰基NAD)，其最早描述在1956年(N.O.Kaplan，J.Biol.Chem.(1956)，221，823)。还表明酶对该辅酶的接受低，并且该辅酶在氧化还原电势上表现出变化。

其它具有修饰吡啶基团的NAD衍生物的使用描述在WO 01/94370中。然而，烟酰胺基团的修饰通常对催化反应具有直接影响。在大多数情形中，该影响是负的。