[发明专利]轮状病毒的环介导等温扩增检测试剂盒

说明书

技术领域：

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种轮状病毒的环介导等温扩增检测试剂盒。

背景技术：

轮状病毒(rotavirus)是世界范围内病毒性胃肠炎的重要病因。目前对轮状病毒感染引起的胃肠炎治疗尚无特效药物。无论在发达国家或是发展中国家，由轮状病毒引起的腹泻均有较高的发病率，是婴幼儿发病和致死的最主要病因。

轮状病毒在离体条件下存活力很强，对各种理化因子有较强抵抗力，耐乙醚和弱酸，用氯仿、反复冻融、超声波处理都不能使其失活，且这类病毒的序列变异较大，有多种血清型存在。近年来，轮状病毒引起的胃肠炎流行在世界范围内有不断上升的趋势，且流行范围广，传染性强，二次攻击率高，常造成急性严重的呕吐和腹泻。虽然不同病毒感染的症状轻重不一，但一般患者都具有低烧、呕吐、腹泻、头痛等严重的脱水样胃肠炎的症状。人群对这几种病毒普遍易感，儿童和老人最为严重，为胃肠炎病毒的危险人群。虽然轮状病毒胃肠炎的流行有一定的季节性，但全年均可发生，可呈暴发流行，也可呈散发流行，因此致使对其不能进行及时有效的防护。

目前轮状病毒病原的检测方法有电镜技术、病毒分离培养技术、免疫学技术及分子生物学技术，但上述的前三种技术往往存在灵敏度较低、操作繁琐耗时、需要大型昂贵的仪器设备等缺点，在应用时往往有其局限性，尤其不能适用于大规模的病原筛查和检测等实际应用。分子生物学技术，其中尤其以RT-PCR检测技术由于其快速、灵敏、适合处理大通量的样品等特点，在病毒检测中显示出其优越性并越来越多的得以应用，但该方法从检测到结果的判读仍然需要多种专用仪器，操作较为繁琐，所需时间仍然在5小时以上，常有非特异性出现等缺陷。与上述几种实验室诊断方法相比，近年来新建立的环介导等温扩增（LAMP）技术由于其对仪器设备要求不高，临床上容易做到，检测时间也较短，不超过3小时，为快速、准确检测轮状病毒探索一种新方法。

发明内容：

本发明的目的是提供一种应用环介导等温扩增检测轮状病毒(rotavirus)的轮状病毒的环介导等温扩增检测试剂盒，利用该检测试剂盒可以特异性的检测轮状病毒(rotavirus)。

本发明的轮状病毒的环介导等温扩增检测试剂盒，包括RNA提取试剂，RNA反转录试剂，环介导等温扩增试剂和检测引物组，其特征在于，所述的检测引物组由下列引物组成：

上游外引物F3：5’-ACCACTCCTTAATGCACAA-3’；（如SEQ ID NO.1所示）；

下游外引物B3：5’-GCCATCCTTTGATTAAAAATAGCT-3’；（如SEQ ID NO.2所示）；

上游内引物FIP：5’-CCTCTCGCGTTGAGTTCGTAT-GGAATAAATCTTCCGATTACTG G-3’；（如SEQ ID NO.3所示）

下游内引物BIP：5’-ATGTTTGTATTACCCAACTGAAGCA-AGAAAGTGTATCCTTCCA TGAA-3’（如SEQ ID NO.4所示）。

所述的环介导等温扩增试剂优选包括反应液A、反应液B和反应液C

反应液A：每24μL含有2.5μL10×Thermopol反应缓冲液、1μl8U/μL Bst DNA聚合酶、0.4μL10mmol/LdNTPs、0.5μL10μmol/L上游外引物F3、0.5μL10μmol/L下游外引物B3、1μL40μmol/L上游内引物FIP、1μL40μmol/L下游内引物BIP、0.6μL100mmol/L MgSO₄、12.5μL2mol/L甜菜碱、4μL灭菌双蒸水ddH₂O；

反应液B：50mM MgCl₂；

反应液C：100×的荧光染料SYBR GreenⅠ。

所述的10×Thermopol反应缓冲液是现有技术中的物质，可以从试剂公司购买到，其含有200mmol/L pH8.8的三羟基甲基氨基甲烷-盐酸（Tris-HCl）、100mmol/L氯化钾（KCl）、100mmol/L硫酸铵（NH₄）₂SO₄、20mmol/L硫酸镁（MgSO₄）和1%曲拉通X-100（TtitonX-100），余量为水。