[发明专利]猪Xist基因序列、猪anti-Xist siRNA序列及通过抑制猪Xist基因表达来提高猪克隆效率的方法

说明书

技术领域

本发明涉及基因工程技术领域，尤其涉及转基因工程技术，具体涉及一种提高猪克隆效率的方法。 

背景技术

1938年，德国科学家Spemanm最早提出并进行细胞核移植实验，之后大量的科学家投入到核移植克隆动物的实验中来，直到1997年英国罗斯林研究所宣布克隆羊“多莉”成功培育，表明体细胞可作为供核细胞进行细胞核移植，为克隆技术的大力发展提供了理论依据，翻开了动物克隆史新的一页。随后大量的克隆动物陆续诞生，而于2000年成功获得了世界上首例用猪胎儿成纤维细胞作为供核细胞的体细胞核移植猪。现已获得的克隆动物有小鼠、绵羊、兔、猪、牛、猴、猫、大鼠、骡子、马、狗、雪貂等。这标志着哺乳动物的核移植克隆技术已日趋成熟。 

同时，动物克隆技术在农业、生物学和医药学等领域有十分广泛的用途。克隆技术可利用优良品种的体细胞作为核供体来克隆动物，可大大缩短育种年限，得到优质动物种群，加速动物育种进程；可利用克隆技术拯救濒危动物，保护珍稀物种、保护生物多样性。克隆技术与转基因技术相结合，对解决人类器官移植来源、改善动物品种、疾病治疗等有重要意义。而猪作为人类疾病治疗的模式生物，其克隆技术对解决人类异种器官移植尤为重要。 

但是，动物克隆技术仍面临一个重要难题，就是克隆效率低的问题。有研究报道，哺乳动物的克隆效率一般不超过3%（出生个体数/核移植重构胚数），而猪的克隆效率更低为1-2%，这大大限制了 动物克隆技术的研究与应用。提高动物克隆效率的研究较多，主要表现在核供体、核受体的选择、供受体间的相互作用和核移植的操作方法等传统方法的研究，但是效果却并不明显，克隆成功率仍不超过3%。 

现有技术基本上是通过供核细胞和受体细胞的选择、供受体细胞间的相互关系及核移植的操作方法等方面来探索如何提高猪的克隆效率，这些技术一定程度上受地域、时间和个体因素差别的影响，因此可重复性差、效果不明显，不适用于大规模的制备克隆动物。 

Xist基因被认为是调控X染色体失活的关键基因，它启动X染色体的失活，在X染色体失活中心开始转录，转录产物通过包围整条X染色体使其沉默，从而实现哺乳动物的剂量补偿效应。而近年来发现Xist基因在克隆动物（或胚胎）中异常表达，推测其与克隆动物（或胚胎）的异常发育或死亡有关。但是目前在猪上，尚未报道有人做过类似的实验，且猪的Xist基因序列并未公布。 

发明内容

本发明目的通过生物信息学方法获得了完整的猪Xist基因序列，为今后进一步研究猪X染色体失活机制及其对克隆动物的正常发育的影响提供了基础。 

本发明的另一目的是提供一种猪anti-Xist siRNA序列。 

本发明的另一目的是提供一种提高猪克隆胚胎的发育质量、继而提高猪的克隆效率的方法，猪克隆效率的提高，可缩短育种年限，培育优良品种。 

本发明的上述目的是通过如下方案予以实现的： 

一种猪Xist基因序列，所述序列为如序列表SEQ ID NO：1所述。 

一种猪anti-Xist siRNA序列，所述序列为如序列表SEQ ID NO：2和3所述。 

一种猪anti-Xist siRNA序列，所述序列为如序列表SEQ ID NO： 4和5所述。 

一种猪anti-Xist siRNA序列，所述序列为如序列表SEQ ID NO：6和7所述。 

一种猪anti-Xist siRNA序列，所述序列为如序列表SEQ ID NO：8和9所述。 

一种通过抑制猪Xist基因表达来提高猪克隆效率的方法，所述方法通过以下步骤实现： 

1）猪Xist基因的电子克隆：对牛、小鼠、人的的Xist的核苷酸序列进行同源性分析，获得相似性90%以上的表达序列标签；对匹配分数高的EST序列进行片段整合分析，延伸EST序列，得到Xist RNA序列； 

2）有效anti-Xist siRNA序列的筛选：以母猪cDNA为模版，设计引物，进行定量PCR反应，筛选有效的anti-Xist siRNA序列； 

3）anti-Xist siRNA1显微注射猪早期核移植胚胎； 

4）anti-Xist-siRNA1转染核移植的供核细胞，用anti-Xist siRNA1抑制克隆胚胎中Xist基因表达，提高体外培养猪克隆胚胎的囊胚内细胞数。 

本发明提供了另一种通过抑制猪Xist基因表达来提高猪克隆效率的方法，所述方法为用anti-Xist siRNA显微注射激活后猪的核移植重构胚，具体步骤如下：