[发明专利]猪Xist基因序列、猪anti-Xist siRNA序列及通过抑制猪Xist基因表达来提高猪克隆效率的方法

权利要求书

1.一种猪Xist基因序列，其特征在于，所述序列为如序列表SEQID NO：1所述。

2.一种猪anti-Xist siRNA序列，其特征在于，所述序列为如序列表SEQ ID NO：2和3所述。

3.一种猪anti-Xist siRNA序列，其特征在于，所述序列为如序列表SEQ ID NO：4和5所述。

4.一种猪anti-Xist siRNA序列，其特征在于，所述序列为如序列表SEQ ID NO：6和7所述。

5.一种猪anti-Xist siRNA序列，其特征在于，所述序列为如序列表SEQ ID NO：8和9所述。

6.一种通过抑制如权利要求1所述基因表达来提高猪克隆效率的方法，其特征在于，所述方法通过以下步骤实现：

1）猪Xist基因的电子克隆：对牛、小鼠、人的的Xist的核苷酸序列进行同源性分析，获得相似性90%以上的表达序列标签；对匹配分数高的EST序列进行片段整合分析，延伸EST序列，得到Xist RNA序列；

2）有效anti-Xist siRNA序列的筛选：以母猪cDNA为模版，设计引物，进行定量PCR反应，筛选有效的anti-Xist siRNA序列；

3）anti-Xist siRNA1显微注射猪早期核移植胚胎；

4）anti-Xist-siRNA1转染核移植的供核细胞，用anti-Xist siRNA1抑制克隆胚胎中Xist基因表达，提高体外培养猪克隆胚胎的囊胚内细胞数。

7.一种通过抑制如权利要求1所述基因表达来提高猪克隆效率的方法，其特征在于，所述方法为用anti-Xist siRNA显微注射激活后猪的核移植重构胚，具体步骤如下：

1）猪Xist基因的电子克隆：对牛、小鼠、人的的Xist的核苷酸序列进行同源性分析，获得相似性90%以上的表达序列标签；对匹配分数高的EST序列进行片段整合分析，延伸EST序列，得到Xist RNA序列；

2）设计合成anti-Xist siRNA序列；

3）筛选出有效的anti-Xist siRNA；

4）制备猪的核移植重构胚，将有效的anti-Xist siRNA序列显微注射到激活后的核移植重构胚中；

5）将处理后的重构胚移植到代孕母猪体内，提高克隆效率。

8.一种通过抑制如权利要求1所述基因表达来提高猪克隆效率的方法，其特征在于，所述方法为用anti-Xist siRNA直接转染核移植的供体细胞，具体步骤为：

1）猪Xist基因的电子克隆：对牛、小鼠、人的的Xist的核苷酸序列进行同源性分析，获得相似性90%以上的表达序列标签；对匹配分数高的EST序列进行片段整合分析，延伸EST序列，得到Xist RNA序列；

2）设计合成anti-Xist siRNA序列；

3）筛选出有效的anti-Xist siRNA；

4）用有效的siRNA转染核移植的供核细胞；

5）用处理后的供核细胞制备克隆胚胎以期提高克隆效率。

9.一种通过抑制如权利要求1所述基因表达来提高猪克隆效率的方法，其特征在于，所述方法为直接敲除核移植的供体细胞中Xist基因，具体步骤为：

1）猪Xist基因的电子克隆：对牛、小鼠、人的的Xist的核苷酸序列进行同源性分析，获得相似性90%以上的表达序列标签；对匹配分数高的EST序列进行片段整合分析，延伸EST序列，得到Xist RNA序列；

2）设计同源重组打靶质粒制备敲除Xist序列的细胞系；

3）用第2）步骤的细胞系作为核移植的供核细胞制备克隆猪，以提高克隆效率。

10.一种通过抑制如权利要求1所述基因表达来提高猪克隆效率的方法，其特征在于，所述方法为制备抗Xist基因的转基因猪，具体步骤为：

1）猪Xist基因的电子克隆：对牛、小鼠、人的的Xist的核苷酸序列进行同源性分析，获得相似性90%以上的表达序列标签；对匹配分数高的EST序列进行片段整合分析，延伸EST序列，得到Xist RNA序列；

2）设计合成anti-Xist siRNA序列；

3）筛选出有效的anti-Xist siRNA；

4）用有效的anti-Xist siRNA构建anti-Xist shRNA质粒；

5）用anti-Xist shRNA质粒制备转基因细胞系；

6）用第5）步骤的细胞系作为核移植的供核细胞制备克隆猪，以提高克隆效率。