[发明专利]一种蜡蚧菌发酵生产几丁质酶的培养基及方法

说明书

技术领域

本发明涉及真菌的发酵培养基及工艺。更具体地，本发明涉及一种蜡蚧菌(Lecanicillium)发酵生产几丁质酶的培养基及方法。

背景技术

蜡蚧菌(Lecanicillium)隶属丝孢菌类(Hyphomycetes)，广泛分布于热带、亚热带和温带，能寄生蚧类、蚜虫类、螨类和粉虱，还可寄生鳞翅目的一些害虫及线虫、蓟马等。20世纪70年代以来，欧洲一些国家及美国、日本等国对利用蜡蚧菌防治温室蔬菜害虫给予极大重视。目前蜡蚧菌、座壳孢菌、拟青霉菌、绿僵菌和白僵菌等都是研究较多的昆虫病原真菌，其中以绿僵菌和白僵菌几丁质酶在国内外研究应用最为广泛（肖燕等，2001），而对蜡蚧菌产几丁质酶的研究在国内外并不多见。用蜡蚧菌发酵生产几丁质酶可为将来真菌防治害虫的深入研究提供科学依据。

发明内容

本发明的目的在于提供一种蜡蚧菌发酵生产几丁质酶的培养基及方法。

本发明首先提供了一种蜡蚧菌发酵生产几丁质酶的培养基，所述培养基的原料配方为：5-15 g/L果糖或麦芽糖，5-15 g/L酵母浸粉或者酵母浸膏，2-8×10^-4mol/L K⁺或Ca²⁺， 0.05-0.2 g/LVc或者V_B6，其余为水，培养基初始pH=5.5-7.0。         

更优选地，所述培养基的原料配方为： 10g/L麦芽糖，10g/L酵母浸膏，4×10^-4mol/L Ca²⁺， 0.1g/LV_B6，，其余为水,培养基初始pH=5.5。

本发明还提供了一种蜡蚧菌发酵产几丁质酶的方法，所述方法包含以下步骤：

（a）将蜡蚧菌接种种子培养基，制得发酵种子液；

（b）将步骤（a）中制得的发酵种子液按接种于权利要求1或2所述的培养基，250mL的三角瓶装液量为50-100 mL，接种量5-15mL，于26℃，转速160 r/min下培养。

   所述种子培养基的原料配方为： 200g/L土豆，葡萄糖20g /L，其余为水，自然pH。

本发明采用的蜡蚧菌为蜡蚧菌L. lecanii FJ28（邱君志等，金属离子对蜡蚧菌几丁质酶活力的影响，激光生物学报，2009年2月）。

采用本发明优化后的培养基，菌龄11d，发酵周期4d，发酵产生结果蜡蚧菌FJ28产几丁质酶为25 U/mL以上。

本发明的发酵方法有发酵周期短；条件温和，易于控制；提供的用于蜡蚧菌发酵生产几丁质酶的培养基，具有几丁质酶产率高，几丁质酶活力高等优点。

附图说明

图1 NAG标准曲线。

图2 不同碳源对产酶的影响。

图3 不同维生素对产酶的影响。

图4 不同氮源对产酶活性的影响。

具体实施方式

本发明用下列实施例来进一步说明本发明，但本发明的保护范围并不限于下列实施例。

实施例1

单因素实验确定培养基最优成分

实施步骤：

（1）种子培养和基础培养基的配制：20%土豆汁（土豆切片熬汁）1L，葡萄糖20g，自然pH。分装于250mL的三角瓶，每个三角瓶含150mL。1.01MPa，灭菌20min。使用前可加入抗生素对培养基预处理。基础培养基（液体诱导培养基）：粉状几丁质2%、KH₂PO₄ 0.1%、MgSO₄^。7H₂O 0.05%、NaCl 0.02%、pH6.5。

（2）发酵种子的制作：将蜡蚧菌FJ28接种于马铃薯琼脂培养基上，于26℃下培养5d，待其产孢子，即活化；将活化后的菌株用接种针将孢子粉接种至种子培养基，26℃，转速160 r/min下培养4d，即为发酵液。

（3）酶液的制备：取步骤（2）下的发酵液在4℃下， 5000 r/min离心，15min，得上清液即为粗酶液待用。按酶活性测定波长550nm处的吸光值。换算成酶活单位U/mL。