[发明专利]一种耐高糖β-葡萄糖苷酶-CBD融合酶及其表达基因和应用

说明书

技术领域

本发明属于基因工程技术及生物质利用领域，具体涉及对耐高糖β-葡萄糖苷酶和纤维素结合结构域融合及其基因的重组表达与应用。

背景技术

随着人们生产和生活水平的提高，能源、资源和环境问题日益受到关注，利用农林废弃物制备生物能源、通过生物技术改善农林产品的品质、提高产品的附加值成为科学家关注的热点，也是发展绿色经济的希望所在。β-葡萄糖苷酶（β-glucosidase，EC3.2.1.21）又称β-D-葡萄糖苷水解酶、龙胆二糖酶、纤维二糖酶、苦杏仁苷酶，是一种能催化水解芳基或烃基与糖基原子团之间的糖苷键的酶（Science,2006,311:484-489.），因而被广泛应用纤维素水解领域。

纤维素作为植物光合作用的主要多糖类物质，是地球上最为丰富的可再生资源，这在石化能源日渐枯竭的今天是一个亟待开发的天然宝库。在纤维素水解过程中，β-葡萄糖苷酶的主要作用是降解纤维二糖生成葡萄糖，从而解除酶解体系中纤维二糖对内切葡聚糖酶(EC3.2.1.4)和外切葡聚糖酶(EC3.2.1.91)活性的抑制，从而提高酶解效率并降低成本(Biotechnology Advances,2000,18:355-383.)。目前使用的商业化纤维素酶主要来源于木霉（Trichoderma sp.），其具有高活力的内切和外切葡聚糖酶，但β-葡萄糖苷酶的活力很低，因此为了解决纤维二糖的抑制作用和提高酶解效率，在降解过程中需加入外源的β-葡萄糖苷酶。目前主要添加黑曲霉（Aspergillus niger）来源的β-葡萄糖苷酶（Novozymes SP188），该酶主要是由水解酶家族3的β-葡萄糖苷酶组成，对纤维二糖具有较高的降解速率，但其耐葡萄糖系数Ki仅为3.4mM（纤维二糖为底物），因而随体系中葡萄糖浓度的升高，其降解纤维二糖的活力将受到极大的抑制，从而影响纤维素的连续酶解速率和效果(Biotechnology for Biofuels,2012,5:31.)。另外，木霉来源的内切和外切葡聚糖酶具有很好的纤维素结合结构域，在纤维素连续降解过程中，大部分内切和外切葡聚糖酶能和没降解的纤维素结合在一起，通过过滤可以实现内切和外切葡聚糖酶的回收，因而可以直接使用在下一次的纤维素降解。但目前使用的β-葡萄糖苷酶没有纤维素结合结构域，与纤维素结合能力很弱，因此主要存在于液体中，在连续酶解过程中需再次添加β-葡萄糖苷酶，增加了成本。因此，得到具有纤维素结合能力、耐高浓度葡萄糖、能有效降解纤维二糖的β-葡萄糖苷酶成为了纤维素低成本降解的关键。

本实验室在前期的研究中发现一个来源于Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum DSM571的耐高糖β-葡萄糖苷酶，其具有优异的耐葡萄糖系数（Ki为600mM）和纤维二糖降解能力，并对其进行了克隆、表达研究(Biotechnology forBiofuels,2012,5:31.)。但是关于该β-葡萄糖苷酶与纤维素结合结构域的融合还没有文献报道。

发明内容

解决的技术问题：针对现有纤维素水解系统中β-葡萄糖苷酶在应用中的缺点，本发明的目的是获得一种耐高糖β-葡萄糖苷酶-CBD融合酶及其表达基因和应用。

技术方案：

一种耐高糖β-葡萄糖苷酶-CBD融合酶，其氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。

表达上述耐高糖β-葡萄糖苷酶-CBD融合酶的基因，其DNA序列如SEQ ID NO.2所示。

包含上述核苷酸序列的重组质粒。

包含上述核苷酸序列的重组质粒pET-BGL-CBD。

包含耐高糖β-葡萄糖苷酶-CBD融合酶基因的重组质粒制备方法，步骤为：

（1）以Thermoanaerobacterium thermosaccharolyticum DSM571的基因组为模板，以P1和P2为引物进行PCR扩增，得到耐高糖β-葡萄糖苷酶基因的PCR扩增产物，所述引物为：

P1：CCCCATATGTCGGACTTTAACAAGGAC，下划线表示Nde I位点；

P2：CCCGGATCCAATGGTCCTAGTGGAAATAAG，下划线表示BamH I位点，并去除终止密码子；