[发明专利]预防植物组培褐变的组合物及其使用方法

说明书

技术领域

本发明涉及植物组织培养技术领域，特别涉及一种预防植物组培褐变的组合物及其使用方法。

技术背景

目前，在许多植物组织培养过程中，褐变是限制其成功率最主要的因素之一。褐变在外植体初代培养、植物愈伤组织的继代、悬浮细胞培养以及原生质体的分离与培养中均经常发生。褐变产物不仅使外植体、细胞、培养基等变褐，而且对许多酶有抑制作用，从而影响培养材料的生长与分化，严重时甚至导致死亡。

目前认为植物组织培养中的褐变主要是由酶促褐变引起的，即培养材料变褐主要是由伤口处分泌的酚类化合物引起的。其发生必须具备三个条件，即酶、底物和氧。引起褐变的酶有多酚氧化酶(PPO)、过氧化物酶(POD)、苯丙氨酸解氨酶等。从初次培养和继代培养过程中试管苗的褐变程度和PPO的活性来看，表明PPO活性的高低是引起培养材料褐变的关键。引起褐变的酶的底物主要是酚类化合物，按其组成可分成3类:苯基羧酸（包括邻羟基苯酚、儿茶酚、没食子酸、莽草酸等），苯丙烷衍生物（包括绿原酸、肉桂酸、香豆酸、咖啡酸、单宁、木质素等），第三类是黄烷衍生物（包括花青素、黄酮、芸香苷等。在正常发育的植物组织中,底物、氧气、PPO同时存在并不发生褐变，是因为在正常的组织细胞内由于多酚类物质分布在细胞的液泡内，而PPO则分布在各种质体或细胞质中，这种区域性分布使底物与PPO不能接触。而当细胞膜的结构发生变化和破坏时，则为酶创造了与PPO接触的条件，在氧存在的情况下使酚类物质氧化成醌，进行一系列的脱水、聚合反应，最后形成黑褐色物质，从而引起褐变。

王栋等在《植物组织培养中的褐化现象及其防止措施》（黑龙江农业科学2008(1)：7～1O）中分析了植物组织培养过程中出现褐变的若干因素，并公开了3大类防止褐变的方法：1、向培养基中添加吸附剂（有聚乙烯吡咯烷酮、活性炭等）和抗氧化剂（抗坏血酸、硫代硫酸钠、谷胱甘肽等）；2、选择适宜培养基和培养条件；3、通过优化组培材料的选择和处理。但是，这3种方法主要还是通过被动解决扩散到培养基质中的酚类化合物，在实际生产过程中还是会存在较高的褐变现象。

王东霞、李长杰等在《如何对抗植物组培的组织褐变》（中国花卉盆景，2002（12）：29～29）中也阐述了类似的方法对植物组培防褐变进行了描述，如添加抗氧化剂、吸附剂，变换固液交替培养，控制培养基pH和温度，进行暗培养，优化选种时间等。这些方法虽然一定程度上降低了组培中的褐变率，但是还有进一步提升的空间。

发明内容

本发明的目的在于：提供一种能有效预防植物组培褐变的组合物及其使用方法。

本发明的另一目的在于：提供一种能有效预防植物组培褐变的组合物的使用方法。

本发明的技术方案是：一种能有效预防植物组培褐变的组合物，其中包含有至少一种能降低酚类物质在培养基中氧化作用的抗氧化剂和至少一种能增强植物外植体内抗氧化酶系的物质。

上述的抗氧化剂可以是抗坏血酸（VC）、硫代硫酸钠、柠檬酸、L一半胱氨酸、谷胱甘肽、芸香苷、二硫苏糖醇、酪氨酸、巯基乙醇、卵清蛋白、维生素B、维生素E、有机酸、蛋白质水解产物、氨基酸、亚硫氢酸钠、氰化钾、多胺中的一种或几种。

上述的能增强植物外植体内抗氧化酶系的物质可以是水杨酸（SA）或者油菜素内酯（BR）。

上述能有效预防植物组培褐变的组合物，其中包含质量比为1-100:1000-3000的抗坏血酸（VC）和油菜素内酯（BR）。

上述能有效预防植物组培褐变的组合物，其中抗坏血酸（VC）和油菜素内酯（BR）的质量比为1-6:160-240。

上述能有效预防植物组培褐变的组合物，其中抗坏血酸（VC）和油菜素内酯（BR）的质量比为1:100。

上述的能有效预防植物组培褐变的组合物，还可以包含一定含量的酚类物质吸附剂，如聚乙烯吡咯烷酮（PVP）或活性炭。

本发明还提供该种预防植物组培褐变的组合物的使用方法：在进行植物外植体培养时将该组合物按照适宜使用浓度添加到培养基中即可，其中典型抗氧化剂抗坏血酸（VC）的浓度为5-15 mg/L，典型抗氧化酶系增强剂油菜素内酯（BR）浓度对应的为0.001-0.5 mg/L。其他抗氧化剂以与VC相同的摩尔浓度使用即可；水杨酸（SA）的施用浓度为5-150 mg/L；吸附剂的使用量为1-5 g/L，PVP为50-500 mg/L。

本发明的有益效果在于：