[发明专利]桦褐孔菌液体发酵产物氯仿提取物在制备治疗糖尿病药物中的应用

说明书

本发明涉及桦褐孔菌发酵菌粉氯仿提取物及其中化合物在治疗糖尿病药物中的应用，该提取物包含19种化合物，19中化合物中的1种或几种组合，可用于制备二肽基肽酶IV抑制剂和治疗糖尿病药物。

技术领域

本发明涉及一种药食用真菌提取物，特别具体涉及桦褐孔菌液体发酵产物氯仿提取物在制备治疗糖尿病药物中的应用。

背景技术

桦褐孔菌（Inonqqus obliquus）属于真菌门、担子菌亚门、层菌纲、非褐菌目、多孔菌科、褐卧孔菌属，是一种寄生在多种树木（白桦、银桦、榆树、赤杨等）树皮上的白腐菌，主要分布于俄罗斯西伯利亚和远东地区、北欧、波兰、我国大小兴安岭以及长白山地区、日本北海道及北美北部等北纬45°～50°的寒冷地区。桦褐孔菌是一种珍稀的药食用真菌，具有多种药用价值，早在16世纪，北欧多个国家的民间就开始食用桦褐孔菌子实体，用来防治胃癌、肠癌、心脏病、糖尿病等多种疾病。由于桦褐孔菌野生资源匮乏，深层发酵技术逐渐被应用于桦褐孔菌的生产。近几年的研究表明，桦褐孔菌提取物表现出多种生物活性，主要有抗癌、抗氧化、降血糖、抗病毒、抗真菌、保肝作用等。越来越多的活性物质被发现，其中主要包括多糖、桦褐孔菌素、桦褐孔菌醇、多种氧化三萜类化合物、羊毛甾醇型三萜类化合物、木质素以及黑色素类等。

二肽基肽酶IV(dipeptidyl peptidaseIV,DPP-IV)是一种跨膜的丝氨酸蛋白酶，属于脯氨酰寡肽酶（prolyloligopeptidase, POP）家族，其广泛分布于肾脏、胃肠道、结缔组织、淋巴结等组织中，具有多种活性。DPP-IV是由两个亚基组成的一种Ⅱ型跨膜糖基化蛋白，分子质量为240kD，由766个氨基酸组成。DPP-IV的活性中心细胞膜外部分C末端区域，凡是N末端第二位上存在脯氨酸(Pro)残基或丙氨酸(Ala)残基的多肽多是其底物，胰高血糖素样肽-1（GLP-1）就是其中之一。GLP-1是由小肠中L细胞分泌的一种内源性激素，主要是通过促进胰岛素分泌、抑制胰高血糖素的释放、延缓胃排空以及胰岛β细胞保护作用来实现控制血糖的目的。GLP-1是由36个氨基酸组成的多肽，其N段第二位为Ala，能够被DPP-IV识别，故其在分泌后很快便被DPP-IV剪切而失去降血糖的活性。因此，抑制DPP-IV的活性，可以减少GLP-1的降解，延长其半衰期，增加其在血液中的浓度，进而起到降血糖的作用。默克公司的sitagliptin于2006年8月获FDA批准在墨西哥上市，是第一个获准上市的DPP-IV抑制剂类药物，该药也是目前唯一在我国上市的此类药物。诺华公司的vildagliptin与百时美施贵宝公司的saxagliptin分别在欧盟及欧美上市，日本武田公司的alogliptin已在日本获准，目前正在申请在美国上市，目前还有很多正处于待批和临床阶段。利用此类药物降糖无低血糖风险、避免了体重增加等副作用，与其他药物（如二甲双胍）联用效果更佳稳定。

发明内容

本发明的目的在于提供桦褐孔菌液体发酵产物的氯仿提取物在制备DPP-IV抑制剂和制备治疗糖尿病药物中的应用。

本发明研究了桦褐孔菌的发酵特性，并采用深层发酵技术制备了桦褐孔菌的发酵产物，50 L发酵罐对桦褐孔菌进行规模化发酵，第9 d生物量达到最大（8.6 g/L）；得到桦褐孔菌菌粉201.96 g，得率6.73 g/L。采用不同溶剂对桦褐孔菌发酵产物进行提取，得到10种提取物，对各提取物抑制活性进行评价，其中菌粉氯仿提取物活性较高，200 mg/L浓度下对DPP-4的抑制率分别为38.1%和31.2%。

本发明采用硅胶柱层析、Sephadex LH-20柱层析、大孔树脂柱层析、制备型HPLC等多种现代分离纯化技术对菌粉氯仿提取物及发酵液甲醇提取物进行分离纯化，200 mg/L浓度下活性组分抑制率分别升高至47.1%和51.7%，分离得到了活性部位。

本发明利用UPLC-Q-TOF-MS对活性部位的化合物结构进行推断，推断出19个化合物的化学结构，其中生物碱类物质10个，甾类、三萜类及其他物质9个。