[发明专利]一种从发酵液中分离纯化WF11899A的方法

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，具体涉及一种从发酵液中分离纯化WF11899A的方法。

背景技术

WF11899A（FR901379）最初是从腔胞纲菌Coleophoma sp.F-11899的发酵培养液中分离得到的一种脂肽类活性化合物，其分子式为C₅₁H₈₂N₈O₂₁S，经过结构修饰改造可得到一种抗真菌抗生素米卡芬净（Micafungin，MFG，FK463）。但是近年来，在其他近缘种中也逐渐发现一些菌株可以合成WF11899A及其结构类似物。

米卡芬净是日本藤泽公司开发的一类新型水溶性棘白菌素类抗真菌抗生素，具有良好的医用市场前景。其作用机制为通过非竞争性抑制β-(1,3)-葡聚糖合成酶的活性来抑制真菌细胞壁合成，且对人体正常细胞影响不大。临床实验表明其对由念珠菌属、曲霉菌属引起的深度真菌感染有广谱抗菌作用，对耐氟康唑、依曲康唑的念珠菌亦有作用。

目前关于WF11899A的纯化方法主要是硅胶柱层析和离心分配色谱。文献“WF11899A,B and C,novel antifungal lipopeptides.I.Taxonomy,fermentation,isolation and physico-chemical properties”（《the Journal ofAntibiotics》,1994,47(10):1084-1091）和欧洲专利EP0431350A1中都公布了一种从Coleophoma sp.F-11899发酵液中分离纯化WF11899A的方法：发酵液用等体积的丙酮浸泡2h，过滤后去除丙酮。乙酸乙酯洗涤2次，活性物质萃取至正丁醇相，处理后上样于Si 60硅胶柱，利用CH₂C₁₂-甲醇混合液洗脱。浓缩后溶解在50%（体积百分比，下同）甲醇水溶液中，过ODS反相柱，用80%甲醇水溶液洗脱，再利用离心分配色谱进一步纯化。包含WF11899A的目标组分液富集后，再上样于硅胶柱、ODS反相柱，得到WF11899A洗脱液。干燥富集后溶于水，调pH至7.0，冷冻干燥后制得白色粉末WF11899A。但是这种方法存在以下缺点：1）分离纯化步骤较多，操作复杂；2）吸附过程中存在不可逆吸附，收率较低。因此，现有技术中关于WF11899A的分离纯化方法均不利于在工业生产上推广应用。

发明内容

本发明所要解决的技术问题是为了克服现有技术中的上述缺陷而提供一种高效率、低成本的从含WF11899A的发酵液中分离纯化WF11899A的方法。

本发明提供的技术方案之一是：一种从发酵液中分离纯化WF11899A的方法，其包括如下步骤：

（1）用C1～C4的醇或酮浸泡含WF11899A的发酵液0.5～3h后，将发酵液进行固液分离，取液体部分；所述的C1～C4的醇或酮与含WF11899A的发酵液的体积比为1︰2～3︰1；

（2）去除步骤（1）得到的液体部分中的C1～C4的醇或酮后，过大孔吸附树脂，以甲醇水溶液洗脱，收集洗脱液，并减压浓缩，得浓缩液；

（3）将步骤（2）所得的浓缩液通过聚苯乙烯反相色谱柱，以乙腈、磷酸二氢铵和水的混合溶液洗脱，对洗脱过程进行HPLC跟踪检测，分段收集WF11899A纯度大于90%的洗脱液，并减压浓缩，得浓缩液；在所述的乙腈、磷酸二氢铵和水的混合溶液中，乙腈的体积百分比为40%～60%，磷酸二氢铵的质量百分比为0.4%～0.6%；

（4）将步骤（3）所得的浓缩液上样于聚苯乙烯反相色谱柱，用纯水冲洗脱盐，然后以纯甲醇洗脱，所得洗脱液即为含有WF11899A的洗脱液。