[发明专利]具有血管化能力的组织工程骨及其制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及工程骨(人工骨)制造技术领域，尤其涉及的是一种具有血管化能力的组织工程骨及其制备方法。

背景技术

大段骨缺损的修复是临床面临的一大难题，目前尚未得到很好地解决。近年来组织工程的发展有望成为治疗大段骨缺损的新方法，但目前组织工程化的人工骨用于大段骨缺损的治疗时有一个关键性的问题尚未克服，即人工骨血管化的问题。但目前的人工骨由于不能解决自身血管化的问题，至使其无法有效修复大段的骨缺损。

发明内容

血管内皮生长因子(VEGF)和血管生成素(Ang-1)是两个在血管形成及塑型过程中起重要作用的两个细胞因子，本发明使用这两个具有高效促血管形成能力的细胞因子与I型胶原改性的多孔支架材料复合，构建新型的双基因修饰的组织工程化人工骨，以期在采用组织工程化人工骨治疗大段骨缺损时能促进人工骨的血管化，进而有效修复大段骨缺损。

本发明的技术方案如下：

一种具有血管化能力的组织工程骨的制备方法，包括以下步骤：A1，VEGF、Ang-1基因质粒的获取及扩增、纯化；

A2，VEGF、Ang-1基因质粒与I型胶原混合溶液的制备；具体方法为：I型胶原蛋白粉末置于0.2mol/L醋酸溶液中，PH＝3.2，配成0.3wt％的I型胶原溶液，4℃中充分搅拌12h，以使其充分溶解；然后将得到的VEGF、Ang-1的质粒与I型胶原溶液混合，质粒浓度按照各20ug/ml配制；

A3，将上述获得的支架材料在真空环境下置于所述的I型胶原混合溶液中抽吸4h，使原始支架孔洞中充分浸入I型胶原溶液；混合物于-80℃冷冻12h后，在真空冻干机中冻干48-72h以使孔洞中形成胶原海绵结构；37℃下用1％戊二醛溶液对胶原海绵结构进行交联10min；用去离子水反复洗涤后置于冻干机中冻干，构建成具有双基因修饰的新型人工骨。

所述的方法，所述步骤A1中，扩增VEGF所用引物对为：

Primer1：GGAAGATCTATGAACTTTCTGCTGTCT；

Primer2：ACGCGTCGACCCGCCTCGGCTTGTCACA；

上游引物Primer1引入Bgl II位点，下游引物Primer2引入Sal I位点。

所述的方法，所述步骤A1中，扩增Ang-1基因所用引物对为：首轮PCR引物：

primer3：AGAGGTCAGAAGAAAGGAGCAA；

primer4：GCCCGACAGTCAGTGGAGT；

第二轮PCR引物：

primer5：ATGACAGTTTTCCTTTCCTTTGC；

primer6：TCAAAAATCTAAAGGTCGAATCATC。

将构建的组织工程人工骨用于动物体内节段性骨缺损的修复，具有良好的修复效果。

附图说明

图1为细胞在支架材料中的增殖情况(n＝4)；

图2为X ray检测结果；(a)-(d).术后即刻X ray检测结果(a)：实验组A；(b)：实验组B；(c)：实验组C；(d)：实验组D。(e)-(h).术后4w X ray检测结果(e)：实验组A；(f)：实验组B；(g)：实验组C；(h)：实验组D。(i)-(l).术后8w X ray检测结果(i)：实验组A；(j)：实验组B；(k)：实验组C；(1)：实验组D。

图3为术后8w MciroCT检测结果；(a)：实验组A三维重建结果及层面截图；(b)：实验组B三维重建结果及层面截图；(c)：实验组C三维重建结果及层面截图；

图4为术后1w硬组织切片改良丽春红三色法染色。(a)：实验组A，(b)实验组B，(c)实验组C；

图5为术后1W硬组织切片CD34染色。(a)：实验组A，(b)：实验组B，(c)：实验组C。

图6为术后4、8w改良丽春红三色染色；(a)：A组4w时，(b)：A组8w时，(c)：B组4w时，(d)：B组8w时，(e)：C组4w时，(f)：C组8w时；

图7为.术后4、8W H.E.染色。(a)：A组4w时，(b)：A组8w时，(c)：B组4w时，(d)：B组8w时；

具体实施方式

以下结合具体实施例，对本发明进行详细说明。

实施例1、VEGF、Ang-1质粒的获取及扩增、纯化

1.VEGF的获取、扩增及纯化

1.1引物设计