[发明专利]过氧化氢抑制IGF-1促存活功能的体外研究

说明书

技术领域

       本发明属于医药技术领域，涉及一种过氧化氢抑制PC12细胞活力的可能机制，即抑制了IGF-1的促存活功能。

背景技术

需氧细胞在代谢过程中会产生一系列活性氧簇(reactive oxygen species, ROS) ，包括超氧阴离子[·O₂^-]、过氧化氢[H₂O₂] 以及羟自由基[·OH] 等，它们的性质极其活跃，会严重地损害生物膜、酶类、蛋白质和核酸等生物大分子，已有的研究表明肿瘤、衰老、心脑血管等许多疾病的发生与ROS 的存在有着密切联系。随着自由基生物学研究的发展，人们逐渐认识到ROS 可以双向调控某些肿瘤细胞的凋亡与增殖，并发现了活性氧自由基与细胞信号转导之间的内在关联。最新研究发现，低浓度的活性氧自由基能够影响一系列信号转导途径。机体内的活性氧自由基通过其浓度调节着机体细胞的生死平衡，除了引起细胞凋亡、坏死的功能外，低浓度的ROS 更广泛的生理意义在于其对转录因子的激活以及对细胞增殖、分化的促进。

胰岛素样生长因子-1 (Insulin-like Growth Factor-1, IGF-1) 是一种在肝脏合成的营养因子，其生物学功能广泛，在中枢神经系统具有促进神经细胞增殖、分化，促进神经元存活的功能，而这些生物学功能都依赖其高亲和力受体IGF-1R来发挥。IGF-1R敲除的转基因小鼠较正常小鼠体重减少约45%，在出生后死于多器官的发育异常，其中神经系统发育缺陷是导致转基因小鼠死亡的重要原因，这显示出IGF-1在中枢神经系统中的重要作用。促神经元存活是IGF-1在中枢神经系统最重要的生物学功能之一，国外许多研究已表明IGF-1能够对抗多种原因导致的细胞损伤，如血清剥夺导致的神经元凋亡，6-羟基多巴胺引起的神经毒性，低钾诱导的凋亡，脑缺血以及谷氨酸的神经兴奋性毒性等。

发明内容

      本发明的目的在于探讨过氧化氢对IGF-1促存活功能的作用，提供一种过氧化氢降低PC12   细胞存活、诱导细胞凋亡的可能机制。以PC12细胞(大鼠肾上腺嗜铬细胞瘤细胞)为研究对象，以剥夺血清作为模型，IGF-1（胰岛素样生长因子-1）用于保护PC12免受剥夺血清造成的损伤，促进PC12细胞存活。而给予IGF-1处理前预先加入不同浓度的H₂O₂（过氧化氢），MTT（噻唑蓝法）检测细胞存活力，结果显示剥夺血清可以明显的降低细胞的存活能力，而IGF-1可以剂量依赖性的保护PC12细胞对抗剥夺血清带来的损伤，而H₂O₂可以剂量依赖性的抑制IGF-1的这种促存活功能。

具体实施方式

本发明具体的操作步骤如下：

1、 细胞的培养   PC12细胞来源大鼠肾上腺髓质嗜铬细胞瘤，广泛用于神经系统疾病的体外研究，培养于含有5%FBS、5%HS、1%PSA的DMEM培养基中，于37℃、5%CO₂条件下培养，待细胞长满后，用含1%FBS、1%PSA的DMEM培养基接种于96孔和24小时后对细胞进行处理。

2、细胞处理  处理前先将细胞换液成纯DMEM 1hour，然后正常组换成DMEM+1.5% FBS，剥夺血清模型组采用纯DMEM，IGF-1给药组给予（2.5ng/ml、25.0ng/ml、50.0ng/ml、100.0ng/ml）IGF-1，继续培养24小时后MTT法检测细胞活力；考察H₂O₂对IGF-1促存活功能的作用是先用不同浓度（10μM，30μM，100μM，200μM，400μM）的H₂O₂预处理细胞1小时，再加入IGF-1处理。

3、MTT检测细胞活力   将细胞以0.5×10⁵/ml接种于96孔培养板,100 μl/孔,在37 ℃ 5% CO₂条件下培养过夜后,按分组要求给以不同处理因素,每组设8 个平行复孔。培养24 h后,每孔加入终浓度为0.5 mg/ml的MTT 100μl ,再培养5 h ,倾去培养液,加DMSO 100μl/孔 ,待甲瓒结晶完全溶解后,用酶联免疫仪在波长570nm 处读取每孔吸光度(A)。取8 孔A值的均数按公式计算 细胞存活率=（试验孔A均值/ 对照孔A 均值）×100 %。重复3 次。