[发明专利]一种反义核苷酸链及其在制备治疗胃癌的药物中的应用

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种特异性碱基修饰反义核苷酸链及其在制备治疗胃癌的药物中的应用。

（二）背景技术

肿瘤的发生是多种因素相互作用导致正常细胞恶变的结果。导致肿瘤发生的外源性因素包括化学、物理、致瘤性病毒和真菌素等，内源性因素则包括肌体的免疫状态、遗传因素、激素水平、DNA损伤、原癌基因的激活和抑癌基因的失活等。归根到底，导致肿瘤发生的核心因素是基因调控的失常，典型表现是肿瘤细胞增殖和死亡速度之比的失衡，其中非常重要的一点便是细胞凋亡的抑制。细胞凋亡是细胞在一定的生理和病理条件下，遵循自身的程序，自己结束自己生命的过程。细胞凋亡是受细胞自身调控的主动过程，该过程具有一定的形态学特征和生物化学的改变，是一系列基因活动引起的级联反应的结果。许多癌基因和抑癌基因都是通过控制细胞凋亡而诱导或抑制肿瘤的发生。这些基因调控的紊乱造成细胞生长的失控，正常凋亡程序受阻而形成细胞的恶变和无限增殖。随着对凋亡研究的不断深入，凋亡机制的逐步揭示和凋亡关键分子的发现，“促进肿瘤细胞凋亡”已成为抗肿瘤治疗的重要策略之一。

miRNA首先由RNA聚合酶家族负责转录形成primary miRNA,primary miRNA由dorsha和DGCR8所形成复合体切割，形成precursormiRNA,precursor miRNA由Exportin 5将其由细胞核转运入细胞质，在细胞质中加工形成成熟体miRNA。miRNA通过与靶基因mRNA 3’端非翻译区（3’UTRs）碱基配对，进而抑制靶mRNA翻译或诱导剪切，从而在转录后水平上对基因的表达进行负调控。

研究发现在肿瘤发生过程中，miRNA的表达谱会出现明显的变化，表明miRNA异常表达调控与肿瘤疾病发生有关，因此受到研究者的重视。在科学实验中，降低在肿瘤中的被特异性过表达的miRNA或者升高在肿瘤细胞中被抑制表达的miRNA能够诱导细胞凋亡，抑制肿瘤生长，这将成为另一种有效的肿瘤治疗手段。

（三）发明内容

本发明目的是提供一种特异性碱基修饰反义核苷酸链及其在制备治疗胃癌的药物中的应用。

本发明采用的技术方案是：

一种特异性碱基修饰反义核苷酸链，其核苷酸序列为：caAgtTcgGatCtaCggGtt，自左往右依次为第1~20位碱基，其碱基修饰方式为：（1）第1~20位碱基硫代修饰、（2）第3、6、9位碱基LNA修饰和（3）第12、15，18位碱基2’OME修饰，上述修饰方式并用。

全硫代修饰后，DNA酶就不容易识别修饰后的短链分子，防止合成的片段在体内被降解，延长作用时间。全硫代修饰结构如下：

LNA（Locked Nucleic Acids）一种类寡核苷酸衍生物，结构中β-D-呋喃核糖的2'-O、4’-C位通过缩水作用形成刚性的结构。LNA降低了核糖结构的柔韧性，增加了磷酸盐骨架局部结构的稳定性。由于与DNA/RNA在结构上具有相同的磷酸盐骨架，故其对DNA，RNA有很好的识别能力和强大的亲和力。与其他的寡核苷酸类似物相比，LNA有很多的优点：（1）和DNA，RNA互补的双链有很强的热稳定性；（2）抗3’脱氧核苷酸酶降解的稳定性；（3）LNA-DNA杂交物能够激活RNase H；（4）水溶性好，能够自由穿入细胞膜，易被机体吸收；（5）体内无毒性作用；其结构如下：

2’OME修饰：即核糖2’位的H被OME取代，OME修饰能够增加片段与RNA的亲和力，同时也能阻止被内源性DNA酶所降解，其结构如下：

本发明采用全硫代、OME和LNA三种方式对AMO-miR-100进行修饰，设计出一种全新的反义核酸链，通过特异的碱基修饰方式增强了其和miRNA结合的能力，并且能够有效防止其被体内的DNA酶所降解，使其抑制效果大大延长，可成功应用于人胃癌细胞的miR-100敲低。本发明序列设计改进了在先申请（CN102311956A）中16个nt的反义核苷酸修饰方式，能够更加有效的抑制miRNA表达，最为关键的是能够在静脉与皮下注射中有效透过血脑屏障（CN102311956A中16nt反义核苷酸则难以通过血脑屏障），提高血液与组织中药物的浓度，降低药物被自身代谢的速率，进而能够抑制肿瘤生长，促进肿瘤细胞凋亡，更加适合临床试验与研究。

本发明还涉及所述的特异性碱基修饰反义核苷酸链在制备治疗胃癌的药物中的应用。具体的，所述药物为诱导胃癌细胞凋亡或抑制胃癌细胞生长的药物。