[发明专利]一种通用的CaMV 35S启动子定量检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及分子生物学及转基因检测技术领域，尤其涉及一种通用的CaMV（花椰菜花叶病毒）35S启动子定量检测方法。 

具体地说，本发明是比对收集到的不同来源的CaMV 35S启动子序列得到增强子序列中较长的保守区，设计以增强子保守区为检测靶标序列的引物探针，筛选出特异性强、灵敏度高的CaMV 35S启动子检测方法。其应用是该方法可适用于CaMV 35S启动子筛查原件的的检测，并解决了原有CaMV 35S启动子检测系统中一些检测方法存在的与检测靶标的匹配性不完全匹配以及存在多条扩增产物等一些无法解决的问题。 

背景技术

近年来，玉米、大豆、棉花、油菜和番茄等转基因作物已在很多国家获准种植和生产，有的被加工成食品、饲料或用作食品添加剂。由于转基因产品的生态安全和食用安全一直备受争议，30多个国家和地区相继实施转基因产品标识制度。 

转基因检测方法，根据检测靶标的不同，分为载体特异性检测、转化事件特异性检测和筛查检测的方法。 

载体特异性检测方法利用基因元件之间的边界序列特征，能够有效鉴定使用类似基因元件的不同构建体，而且存在序列信息容易获得的特点，因此被很多研究者所使用。但是，由同一构建体可能获得不止一个不同特性的转化株，甚至可能被转化到不同的物种中，而这些转化株未必全部经过了安全评估。因此载体特异性检测方法不能识别不同的转基因品系，也不能判别该转基因品系是否已经过安全评估。 

事件特异性检测的基础是转基因构建体在基因组DNA序列上的整合位点具 有高度特异性，即使是相同的载体多次转化，整合的位置和整合位点特征也是不可重复的。因此，根据不可重复的整合位点特征序列，开发出了事件特异性的检测方法。与前两种方法相比，事件特异性检测具有最高的特异性，最适合做转基因产品的定性和定量检测。但转基因构建体的完整信息通常难以获得，而已知序列基因元件可能距边界有相当的距离，而且在整合的过程中，载体和基因组之间可能发生复杂的重组，因此，分离旁侧序列成为事件特异性检测的关键。 

筛查方法具有最低的特异性，其追求的是对不同转基因品种的高覆盖率。因此转基因筛查方法往往选择最常用的转基因元件作为筛查靶标。来自CaMV的35S蛋白基因启动子和来自农杆菌Ti质粒NOS基因的终止子是最为常用的转基因元件。这两个元件广泛存在于各种商业化转基因作物和各种用于研究的转基因载体系统。因为以上原因，CaMV 35S启动子和NOS终止子是应用最广泛的最基本的筛查元件。在众多的法规和研究论文中，不同机构和研究者提够了各种不同的筛查检测方法。但是，在我们的实践中，我们发现与NOS终止子的检测方法相比，CaMV 35S启动子的很多方法在很多品种的检测中存在这样那样的问题。事实上CaMV 35S启动子是被改造得最为严重的转基因元件之一，不同转基因品种中的CaMV 35S启动子的序列可能千差万别。利用某一方法对不同品种中的CaMV 35S启动子进行检测也可能产生完全不同的检测结果，造成阴性结果、非特异扩增和灵敏度下降等严重问题。以上问题影响了CaMV 35S启动子作为筛查元件的可靠性，并给转基因筛查工作造成了困难。 

发明内容

本发明的目的就在于克服现有转基因筛查技术中CaMV 35S启动子检测方法在检测工作中存在的不足，提供一种通用的CaMV 35S启动子定量检测方法。 

本发明的目的是这样实现的： 

一、一种通用的CaMV 35S启动子定量检测方法 

本方法包括下列步骤： 

①收集CaMV 35S启动子增强子保守区序列： 

收集GMDD（GMO Detection Method Database，转基因检测方法数据库，http://gmdd.shgmo.org/）所公布的不同转化事件来源的CaMV 35S启动子序列， 通过其序列比对结果，以其增强子序列的保守区为检测靶标，其序列特征是： 

由来源于野生型CaMV 35S启动子第7018至7344个碱基组成，如图1所示： 

②利用该序列特征设计引物探针： 

a、合成引物序列如下： 

35SEnhF187：5’CATCATTGCGATAAAGGAAAGGC 3’和35SEnhR311：5’TGCTTTGAAGACGTGGTTGGA 3’； 

b、合成TaqMan探针序列如下： 

35SEnhFP230：5’FAM－CCGACAGTGGTCCCAAAGATGG－BHQ13’； 

③PCR扩增：