[发明专利]TELKP和LKP融合免疫毒素、原核表达载体及制备

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，特别涉及TELKP和LKP融合免疫毒素、原核表达载体及制备方法。

背景技术

肿瘤生物治疗近年来迅猛发展，因其高效低毒、目标明确而成为继手术、放、化疗以来的又一重要治疗策略。生物毒素是肿瘤生物治疗重要内容之一，但因生物毒素对靶细胞的作用不具特异性，限制了其在临床的广泛应用。近年，有研究者尝试将特异性抗体与生物毒素分子偶联开发出第二代免疫毒素，但由于偶联分子的分子量增大，其应用效果也不理想。因此，开发具细胞靶向性小分子毒素是未来免疫毒素研究的主要方向。

丝瓜毒素(Luffin-β)，是从丝瓜籽中分离到的I型核糖体失活蛋白(ribosomeinactivating protein,RIP)，丝瓜RIP有多种类型，主要为Luffin-a,Luffin-β,Luffin-Ss，Luffin-cylin,Luffin-P1，其中Luffin-β含278个氨基酸,分子质量30.583KD，等电点9.5，能特异水解真核细胞核糖体28srRNA4324位的腺嘌呤，使真核细胞核糖体60s大亚基失活，显著抑制其蛋白合成，属目前单链RIP中活性最高者之一，是近年备受关注的新型强效免疫毒素弹头小分子（Poma,A.,G.Marcozzi,et al.(1999).Antiproliferative effect and apoptotic response in vitro of human melanoma cells to liposomes containing the ribosome-inactivating proteinluffin.Biochim Biophys Acta1472(1-2):197-205.Poma,A.,M.Miranda,et al.(1998).Differential response of human melanoma and Ehrlich ascites cells in vitro to the ribosome-inactivating protein luffin.Melanoma Res8(5):465-467。Ma,Q.J.,J.H.Li,et al.(2003).Crystal structure of beta-luffin,a ribosome-inactivatingprotein,at2.0A resolution.Acta Crystallogr D Biol Crystallogr59(Pt8):1366-1370.），具较强抗瘤活性。

尿激酶型纤溶酶原激活剂（urokinase plasminogen activator，uPA）是含431个氨基酸残基，分子质量为50～60kD的一糖蛋白。在正常组织、细胞uPA及其uPAR表达极低，而几乎所有的肿瘤，两者明显高表达。uPA与肿瘤的生长、浸润与转移等均密切相关( B,Renk I,Oruzio DV，and et al.Tumour budding,uPA and PAI-1are associated with aggressive behaviour in colon cancer[J].J Surg Oncol.2010,102(3):235-41.FongY，Shen KH,Chiang TA,and et al.Acacetin inhibits TPA-induced MMP-2and u-PA expressions of human lung cancer cells throughinactivating JNK signaling pathway and reducing binding activities of NF-kappaBand AP-1[J].J Food Sci,2010,75(1):H30-8）。因此，uPA被视为重要的肿瘤标志物和极具吸引力的肿瘤治疗靶标。

将尿激酶型纤溶酶原激活剂（urokinase plasminogen activator，uPA）裂解位点（也称uPA识别位点，简写为uPAcs，氨基酸序列为SGRSA）和丝瓜毒素分子(Luffin-β)构建融合基因表达载体，诱导并纯化其表达的融合免疫毒素。该融合免疫毒素在体内高表达uPA的肿瘤组织细胞局部，经uPA酶切割裂解位点序列将释放具杀瘤活性的小分子毒素Luffin-β，以发挥其杀瘤作用。

发明内容

鉴于Luffin-β的抗肿瘤生物学特性及uPA与肿瘤的密切关系，本发明的目的之一是提供一种融合免疫毒素TELKP，氨基酸序列如SEQ ID NO.1所示。