[发明专利]快速制备人外周血淋巴细胞早熟凝集染色体的方法

说明书

技术领域

本发明属于细胞遗传学领域，具体涉及人外周血淋巴细胞早熟凝集染色体的制备方法。

背景技术

早熟凝集染色体(Premature Condensed Chromosome，PCC)最经典的概念是指将处于分裂期(M期)的细胞与处于细胞周期其他阶段的细胞融合，其他期细胞的染色质提早包装成染色体。由于G1、S、G2的DNA复制状态不同，早熟凝集的染色体的形态各异，如与M期细胞融合的G1期的染色体为单线状，S期为粉末状，G2期染色体为双线。

早熟凝集染色体PCC作为辐射剂量估算的方法，受到了广泛的关注和认可。早熟凝集染色体比常规染色体法具有很强的优势：①可诱导静止期细胞的分裂，可大大增加分析细胞的数量，避免了常规染色体畸变分析中只对分裂期细胞进行选择性分析的不足；②得出的染色体损伤为原始损伤，有利于观察到局部照射或“旁效应”辐射能量在细胞内的直接或间接沉积，增加了适用的剂量评估范围，提高了方法的敏感性和结果的准确性；③PCC操作简便、省时，而常规染色体分析需要丰富的经验和熟练的技巧，且给出剂量的时间需4-5d，对大批伤员不能及时提供剂量估算。因此使用PCC用于估算受照人员的辐射剂量，在大剂量的辐射事故中，可以提供足够的可供分析的染色体。④PCC还有其它优势，比如与受照剂量有严格的定量关系，以及用离体实验建立的剂量效应刻度曲线与整体实验所得到的剂量效应曲线无显著性差异(Gotoh E，Tanno Y，Takakura K.Simple biodosimetry method for use in cases ofhigh-dose radiation exposure that scores the chromosome number ofGiemsa-stained drug-induced prematurely condensed chromosomes(PCC).Int J Radiat Biol.2005，81(1)：33-40.)。

但是早期的细胞融合方法制备PCC细胞费时、技术要求高、PCC产额低、不稳定等限制了它作为生物剂量计的应用。最近，一些具有促进细胞分裂作用物质的发现和应用，取代了过去传统PCC中的细胞融合技术，使制备PCC对技术的要求大为降低，缩短了分析时间，如冈田酸(okadaicacid)和花萼海绵诱癌素A(calyculin A)。冈田酸可使外周血淋巴细胞在G1、G2和M期发生PCC，但是，诱导PCC过程中的淋巴细胞培养阶段都需要至少48小时。calyculin A可诱导任一时相的细胞发生PCC，大大提高了可用于分析细胞的数目(Prasanna PG，Escalada ND，Blakely WF.Induction of premature chromosome condensation by a phosphataseinhibitor and a protein kinase in unstimulated human peripheralblood lymphocytes：a simple and rapid technique to study chromosomeaberrations using specific whole-chromosome DNA hybrid.Mutat Res，2000，466(2)：131-41.)，但诱导PCC过程中的淋巴细胞培养阶段时间仍需大约48小时。

发明内容

本发明的目的在于建立快速制备人外周血淋巴细胞早熟凝集染色体的方法，以解决现有技术制备人外周血淋巴细胞早熟凝集染色体耗时长的问题。

本发明的目的可以通过采用以下技术方案来实现：

快速制备人外周血淋巴细胞早熟凝集染色体的方法，包括如下步骤：

(1)、植物凝血素处理(PHA)：采集3-5ml血样，向血样中加入植物凝血素至终浓度80-120μg/ml，混匀后置于37℃恒温培养箱内静置45-90分钟；

(2)、混合培养：将植物血凝素处理后的血样离心，取中层分界处的淋巴细胞，置于含有250μg/ml秋水仙素、10mmol/L ATP、5％胎牛血清、500nmol/L CalyculinA以及0.2mg/ml CDK1/CyclinB的混合培养液中，混匀后置于37℃恒温培养箱内静置培养3-12小时；

(3)、细胞低渗处理：细胞混合培养后，离心弃上清，使用0.075molKC13-5ml低渗10-20分钟；