[发明专利]一种检测M BCR融合基因mRNA表达量的试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体涉及一种检测M BCR融合基因mRNA表达量的试剂盒。

背景技术

慢性粒细胞白血病（chronic myelocytic leukemia,CML）患者的血细胞中除了90%出现Ph1染色体阳性以外，还多伴随有t(9；22)(q34；q11)易位，即位于9号染色体长臂上的abl原癌基因易位到22号染色体长臂的断裂点集中区bcr，形成M BCR融合基因。该融合基因负责编码具有增强酪氨酸激酶的活性的P210蛋白，从而改变细胞多种蛋白质酪氨酸磷酸化水平和细胞微丝机动蛋白的功能，导致细胞内信号传导异常，使细胞丧失对周围环境的反应性，延缓凋亡的发生。

BCR-ABL融合基因转阴率和Ph+细胞消失率与慢性粒细胞白血病患者的疾病进展密切相关。一旦BCR-ABL融合基因转阴率和Ph+细胞消失率得不到及时改善，慢性粒细胞白血病将有可能从慢性期发展到加速期和急变期。酪氨酸激酶抑制剂是治疗慢性粒细胞白血病的主要药物，但有患者对此类药物存在原发性抵抗或者由于长期给予此药而出现继发性抵抗，发生药物抵抗的主要原因与M BCR融合基因的表达水平有关。M BCR融合基因表达水平高的急变期多表现对此类药物的敏感性降低，同时诱变出对此类药物抵抗的突变克隆的时间缩短。

实时荧光定量PCR（Polymerase Chain Reaction，聚合酶链式反应）技术实现了PCR从定性到真正意义的定量的飞跃，为人类疾病基因的定量检测提供了一个行之有效的检测工具，与普通PCR相比具有更强的特异性和灵敏度，而且检测快速、降低了污染等优点，但目前尚未有关实时荧光定量PCR方法检测M BCR融合基因。

发明内容

为解决上述技术问题，本发明实施例提供了一种检测M BCR融合基因mRNA表达量的试剂盒。

本发明所提供的检测M BCR融合基因mRNA表达量的试剂盒，包括检测用引物、荧光探针、cDNA第一链合成试剂、荧光定量PCR混合液、阴性对照和阳性对照，所述检测用引物、荧光探针包括M BCR融合基因引物、内参基因ABL引物及Taqman荧光探针，其中：

M BCR融合基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:1所示；

M BCR融合基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:2所示；

M BCR融合基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:3所示；

ABL基因上游引物序列如序列表中SEQ ID NO:4所示；

ABL基因下游引物序列如序列表中SEQ ID NO:5所示；

ABL基因Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:6所示；

所述cDNA第一链合成试剂含有MgC1₂、逆转录酶缓冲液、dNTPs、RNA酶抑制剂、Oligo(dT)₁₅、AMV逆转录酶和无RNase去离子水；所述荧光定量PCR混合液含有PCR预混合液、Mg²⁺、dNTPs、dUTP、Taq酶、UNG酶和无RNase去离子水。

进一步地，所述试剂盒还包括内部阳性控制序列、内部阳性控制序列的引物和Taqman荧光探针，其中：内部阳性控制序列如序列表中SEQ ID NO:7所示；内部阳性控制序列的上游引物如序列表中SEQ ID NO:8所示；内部阳性控制序列的下游引物如序列表中SEQ IDNO:9所示；内部阳性控制序列的Taqman荧光探针如序列表中SEQ ID NO:10所示。

进一步地，所述M BCR融合基因Taqman荧光探针和ABL基因Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团FAM，3’端均连接有荧光淬灭基团TAMRA，所述内部阳性控制序列Taqman荧光探针的5’端连接有荧光报告基团TET，3’端连接有荧光淬灭基团TAMRA。

具体地，所述内参基因ABL的核酸序列如序列表中SEQ ID NO:11所示。

具体地，所述阴性对照为去离子水；所述阳性对照为含有M BCR融合基因的总RNA样品。

具体地，所述cDNA第一链合成试剂为：25mmol/L MgC1₂4μL，10×逆转录酶缓冲液2μL，10mmol/L dNTP 2μL，RNA酶抑制剂0.5μL，Oligo(dT)₁₅0.5μg，AMV逆转录酶1.5U和无RNase去离子水，总体积11μL。