[发明专利]基于定量PCR的使用重复DNA元件作为阴性对照预测用于下一代测序的靶标富集的效率的方法

说明书

技术领域

本发明涉及DNA文库组成分析领域，特别是分析DNA文库中的序列的相对丰度变化的方法。

背景技术

用于对基因组测序的更为有效的技术的需求已导致下一代基因组测序技术的开发。虽然这些下一代测序技术已彻底改革了对基因组测序的方式，这些技术具有其弱点。例如，这些技术不能容易地靶向基因组的特定区域。

对基因组的特定区域测序的能力具有许多应用。例如，一些疾病由仅仅少数核苷酸的突变引起。对整个人类基因组测序以鉴定这些少数突变是低效的。类似地，许多复杂疾病涉及单核苷酸多态性(SNP)或与疾病风险关联的SNP组。鉴定基因组中的此种SNP是费力的任务，因为其包括对来自受侵袭个体的基因组DNA的大的区域(典型地，大于100千碱基)测序以查找单个碱基变化或鉴定所有序列变体。

为了使该任务便利，已开发了更新的方法，所述方法包括在分析或测序之前针对感兴趣的序列富集文库。富集之后，感兴趣的序列的亚组可被更为有效地测序。富集系统典型地使用含有感兴趣的区域周围的序列的寡核苷酸探针作为诱饵从DNA文库钓取(通过杂交)感兴趣的DNA片段。这些寡核苷酸探针通常包括可促进杂交序列从文库分离的把手。

这种富集系统的例子是从Agilent Technologies，Inc.(Santa Clara，CA)可得到的SureSelect^TM系统。SureSelect^TM系统使用基于生物素-抗生素蛋白的选择技术以富集感兴趣的序列。该系统可显著改进测序工作流程的花费和过程效率。

图1显示了图解使用SureSelect^TM从文库中富集感兴趣的DNA序列的方法的图。如在图1中所示的，通过将序列片段克隆进连接物(adaptor)中，制备基因组文库样品。接着用生物素标记的RNA诱饵(即，有生物素标签的RNA寡核苷酸)探查该文库。杂交后，使用链霉亲和素-涂覆的磁珠从混合物中分离与生物素标记的诱饵结合的序列。洗涤珠粒(具有结合的序列)，然后消化RNA序列以释放作为单链DNA序列的富集的靶标序列。然后可使用PCR扩增感兴趣的DNA序列以产生用于进一步分析或测序的富集的序列。该富集方法允许人们相对容易地关注感兴趣的序列。

最近在美国专利申请No.20110184161中公开了类似的方法。根据在该申请中描述的方法，含有片段化的变性的基因组核酸分子的样品在杂交条件下与固定在底物上的寡核苷酸探针接触。然后与固定的探针杂交的感兴趣的核酸分子与其他序列分离，并且结合的DNA片段被从底物中洗脱出来以产生富集的文库。

对于此类富集方法，期望的是，在人们做出努力来对富集的文库测序之前，能够证实靶标序列的确被富集(以及富集到什么程度)了。因而，在富集方法中通常包括阳性对照序列和诱饵以容许对富集监测。如果富集的定量估计是期望的，也可包括内标物序列。富集循环后或当富集的估计是期望的时，可从富集的文库中取出一小份并典型地用扩增技术，比如定量PCR(qPCR)进行分析。

定量PCR(qPCR)(或实时PCR)可用来扩增并同时定量靶向的DNA分子。所述方法包括扩增DNA样品中的一种或多种特定序列的PCR。同时，在反应混合物中包括探针(典型地，荧光探针)以提供实时定量。用于实时PCR产物的定量的两种常用的荧光探针是：(1)以非序列特异性方式嵌入双链DNA分子的非-序列-特异性荧光染料(例如， Green)，和(2)仅在与DNA靶标杂交后或并入PCR产物后容许检测的序列-特异性DNA探针(例如，标记有荧光报告子的寡核苷酸)。

荧光报告子的例子可包括具有被另一基团淬灭的一种荧光团的探针。当探针被并入扩增的序列时，荧光团分子或荧光淬灭剂分子被切割，允许荧光团发光。该方法的例子是检验，如在美国专利NO. 5,723,591中描述的。检验使用中心探针寡核苷酸侧翼的两条PCR引物。探针寡核苷酸含有荧光团和淬灭剂。PCR方法的聚合步骤期间，聚合酶切割探针寡核苷酸。该切割引起荧光团和淬灭剂被物理上分离，这引起荧光发射变化。因为产生了更多PCR产物，荧光信号的强度增加了。

用这些现有技术，人们可以更高的可信度监测DNA文库的富集。但是，仍存在对可用来监测富集过程的方法的需要。

发明内容