[发明专利]向日葵黑茎病菌实时荧光PCR检测试剂盒

说明书

技术领域

本发明涉及生物检测技术，具体的说涉及向日葵黑茎病菌检测用试剂盒。

背景技术

向日葵黑茎病(Phoma macdonaldii Boerma)首次于20世纪70年代后期发现于欧洲，现在法国、罗马尼亚、匈牙利、塞尔维亚、前苏联、前南斯拉夫、澳大利亚、加拿大、美国、阿根廷、伊朗、伊拉克等国均有发生。主要在茎杆上生成典型的大型病斑，黑色，有光泽，具清晰的边缘。最初发生于叶柄基部，迅速向茎秆扩展，形成黑色病斑，可达几寸长，引起叶片萎缩干枯。严重时，茎上病斑可环绕茎秆，整个茎秆也可能全部变黑，植株枯熟，提前干枯。另外，在叶片、花盘背面、根颈和茎基部也发生黑色病斑。茎部表面发生黑色小粒点，即病原菌的分生孢子器，肉眼看不清楚，需用手持放大镜观察。2008年，陈卫民等人报道了新疆伊犁地区发现向日葵黑茎病。目前此病在我国新疆伊犁地区新源县、特克斯县、尼勒克县发生，发生面积16200hm²，经济损失28～80％。

国内外对向日葵黑茎病菌的研究较少，对其它茎点霉研究较多，国外Victor Morales等对部分茎点霉5.8S和ITS区域序列进行了研究；Franco Rollod等利用PCR对柠檬梢枯病原菌(Phoma tracheiphila)进行快速检测。2008年新疆伊犁职业技术学院陈卫民等人报道了新疆伊犁地区发现向日葵黑茎病，并对该病菌的形态学、发生程度等作了初步研究。到目前为止还没有特别有效的化学药剂或抗性品种来防治此病，由于向日葵黑茎病菌主要通过向日葵种苗进行传播，所以目前主要控制方法是通过对进境向日葵种苗进行检验检疫。目前国内外未见有关该病菌的检测试剂盒研究的报道。因此，有必要建立一种准确率和灵敏度均高的快速检测试剂盒来检测向日葵黑茎病菌。由于该病是我国的检疫性病害，因此在我国检疫是主要控制此病害的手段，严格限制或禁止从发生此病害的国家和地区进口向日葵种苗，从其它国家进口的向日葵种苗也必须在口岸检验检疫局进行检验。目前国内外检测向日葵黑茎病菌所采取的手段主要是：

1.种植观察：将进境的向日葵种苗按照检验检疫机构的要求进行隔离种植，在种植期间定期观察有无表现向日葵黑茎病菌的典型症状。此法只能作为初步判断，且费工、费时、结果判断的准确率低。

2.分离培养：将进境的向日葵种苗在培养基上进行分离纯化，该方法检测周期长，经验性强，阳性样品确定难度大，灵敏度不高。

随着我国对外开放不断发展，农产品进出口日益频繁，传带农业植物有害生物的机率进一步加大，有害生物的危害性进一步增强。向日葵自上世纪以来迅速发展，国内外调种批次多，数量大，来源复杂，检疫问题非常突出。自2000年以来，我国每年从美国、德国等地引进大量向日葵种子，进口的数/重量均位居进境植物繁殖材料的前列，口岸检验检疫局每年从进口的向日葵种子检出多种有害生物。但目前我国各口岸检验检疫机构缺乏对向日葵黑茎病菌的有效检测试剂盒。病害防治、预测预报及植物检疫需要有准确快速的检测试剂盒，尤其是需要我国拥有自主知识产权的检测试剂盒，从而可以将之投入到商业生产和应用中，目前国内外在这一领域还没有向日葵黑茎病菌实时荧光PCR检测试剂盒的报道。此项发明满足了这些需求。

发明内容

本发明的目的是为了解决现有技术中向日葵黑茎病菌的种植观察所需周期长、鉴定困难、准确率低等问题，提供向日葵黑茎病菌的快速检测试剂盒。

本发明通过分析本实验室测序的结果和已报道茎点霉核糖体基因序列，设计引物和荧光探针。引物对由正向和反向引物组成，其核苷酸序列如序列表LEPf&LEPr所示；探针的核苷酸序列如序列表PMp所示，该探针一端标记有报告荧光染料，另一端标记有淬灭荧光染料。可用的报告荧光染料有FAM/hex/tet/joe/vic/fitc/cy3/cy5，可用的淬灭荧光染料有TAMRA/rox/dabcy1/bhq1/bhq2。

根据TaqMan技术，在常规PCR的基础上添加了一条标记了两个荧光染料基团的核苷酸探针，例如将报告荧光染料标记在探针的5′端，淬灭荧光染料标记在探针的3′端，两者构成能量转移结构，即报告荧光染料所发射的荧光可被淬灭荧光染料吸收，当二者距离变远时，抑制作用减弱，报告荧光染料信号增强。在扩增反应过程中，探针同模板上的目的扩增片段杂交，由于Taq DNA聚合酶具有5′端到3′端的外切酶活性，在扩增延伸阶段将探针切断，淬灭荧光染料的抑制作用消失，报告荧光染料信号增强，从而实现对向日葵黑茎病菌的检测。