[发明专利]杂色曲霉毒素的酶联免疫吸附试剂盒制备及检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及生物技术领域，具体为对杂色曲霉毒素酶联免疫吸附检测专用试剂盒的制备及专业检测。

背景技术

杂色曲霉素(ST)主要是杂色曲霉和构巢曲霉的最终代谢产物，同时又是黄曲霉和寄生曲霉生成黄血霉毒素过程后期的中间产物。据报道，感染了杂色曲霉的玉米在27℃的环境下，21天可产生杂色曲霉毒素12 g/kg以上。杂色曲霉毒素在1954年由杂色曲霉培养物中首先分离出的，但并未引起人们的足够重视，至发现黄曲霉毒素的强致癌性后，才开始注意。用14~标记方法已证实杂色曲霉毒素能转变成黄曲霉毒素马，而且有人认为杂色曲霉毒素可能是非洲某些地区肝癌的病因。 

能产生ST的菌种主要是杂色曲霉、构巢曲霉和离蠕孢霉。此外，谢瓦曲霉、赤曲霉、焦曲霉、阿姆斯特丹曲霉、黄褐曲霉、四脊曲霉、变色曲霉、爪曲霉、毛壳霉及黄曲霉和寄生曲霉等也可产生ST。上述这些霉菌广泛存在于自然界， 可污染大麦、小麦、玉米、花生、大豆、咖啡豆、火腿、奶酪等粮食、食品和饲草，尤其对小麦、玉米、花生等饲料和饲草污染更为严重。产毒量最高的是杂色曲霉，其次是构巢曲霉和离蠕孢霉，前者产生ST的量约为后者的2倍。

本发明为杂色曲霉毒素的酶联免疫吸附检测专用试剂盒。其检测快速、灵敏、准确、可定量，操作简便，且对样品纯度要求不高，特异性强，特别适用于大批量样品的检测。

发明内容

本发明提供了专用试剂盒的制备及检测方法。其中包括洗涤液，显色液，终止液。其特征在于：包有杂色曲霉毒素固相抗原的包被板、杂色曲霉毒素（ST）标准品，杂色曲霉毒素单克隆抗体、杂色曲霉毒素酶标抗体。

检测时，取包被板，加入标准品/样本50μL到对应的微孔中，再加入酶标记物50μL/孔，然后再加入50μL/孔抗体工作液，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置室温避光反应30 min。小心揭开盖板膜，将孔内液体甩干，加洗涤液 250 μL/孔，每次浸泡15~30 s，充分洗涤4~5次，用吸水纸拍干。加入显色液100 μL/孔，轻轻振荡混匀，用盖板膜盖板后置25℃避光环境反应15 min。每孔各加50 μL终止液，设定酶标仪在450 nm处，测定OD值（建议用450/630 nm双波长检测，在5 min内读完数据）。从标准曲线中计算样品中ST的含量。测得的标准液或样品吸光度的平均值（B）除以第一个标准液（0标准液）的吸光度（B₀）值再乘以100%，得到百分吸光度值，

百分吸光度值（%）＝B/B₀×100%

以标准品浓度的10为底的对数为X轴， 百分吸光值为Y轴，绘制标准曲线。将样本的百分吸光值代入标准曲线，从标准曲线上读出样本所对应的值，作为10的幂，乘以稀释倍数，即为样品中所含杂色曲霉毒素的量。

附图说明

图1为杂色曲霉毒素标准曲线图。

具体实施方式

实施例1 样本前处理方法

准确称取5.00 g样品，加45 mL乙腈，5 mL含有4%KCl的40％硫酸溶液后，在振荡机上振荡30 min倾出清液，再用10 mL乙腈分两次洗残渣，收集乙腈液并与上述提取液合并，合并的提取液用石油醚脱脂三（石油醚用量为20，15，10 mL），脱脂后的提取液加水25mL，用氯仿萃取三次（氯仿用量为20，15，10mL），收集的氯仿层在低温（-6℃）下冷冻，然后过滤去冰，去脂，用旋转蒸发器蒸干（温度40℃以下），残渣用样品稀释液溶解后供色谱测定用。

实施例2 杂色曲霉毒素的酶联免疫吸附试剂盒制备

1、杂色曲霉毒素固相抗原的包被板制作，包括包被原的制作封闭、液的配置、以及孵育。把包被原加入包被液用作固相抗原的包板制作。包被液：1.6 g碳酸钠加上2.9 g碳酸氢钠，加双蒸水至1000 mL，调节pH至9.6。封闭液：1 gBSA，100mLPBS。包板时每孔100 μL包板液，37℃下孵育2 h，后取出洗板两次，加封闭液，每孔180 μL，37℃下孵育1.5 h，取出甩干，加干燥剂2~8℃保存；

2、包被原的偶联：