[发明专利]杂色曲霉毒素的酶联免疫吸附试剂盒制备及检测方法

权利要求书

1.杂色曲霉毒素试剂盒的制备，包括洗涤液，显色液，终止液；其特征在于：包有杂曲霉毒素固相抗原的包被板、杂色曲霉毒素（ST）标准品，杂色曲霉毒素单克隆抗体、杂色曲霉毒素酶标抗体。

2.杂色曲霉毒素固相抗原的包被板制作，包括包被原的制作、封闭液的配置、以及孵育；包被原的偶联：根据杂色曲霉的结构特征偶联载体蛋白BSA方法如下：

碳二亚胺（EDC）法偶联杂色曲霉毒素半抗原与蛋白载体；   取5 mg 杂色曲霉毒素半抗原和2.5 mg cBSA溶解在250 μLTE buffer（pH 8.0）中，充分震荡使其溶解，再取EDC·HCl 79 mg充分溶解于250 μL TE buffer（pH 8.0）中；将杂色曲霉毒素半抗原和cBSA的混合溶液边震荡边逐滴加入EDC溶液，在37℃摇床中反应2 h以上；先用Sephadex柱分离偶联产物和未结合的杂色曲霉毒素半抗原小分子；再透析纯化，将0.5 mL溶液在PBS中透析3 d，每天换液两次，每次换液200 mL；制得的杂色曲霉毒素偶联物透析产物小剂量分装，于-20℃保存，备用；包被原加入包被液用作固相抗原的包板制作；包被液：1.6 g碳酸钠加上2.9 g碳酸氢钠，加双蒸水至1000 mL，调节pH至9.6；封闭液：1 g BSA，100 mL PBS；包板时每孔100 μL包板液，37℃下孵育2 h，后取出洗板两次，加封闭液，每孔180 μL，37℃下孵育1.5 h，取出甩干，加干燥剂2~8℃保存。

3.根据权利要求书第一条所述，杂色曲霉毒素单克隆抗体制备方法

I材料和方法

（1）试剂

人工抗原：杂色曲霉毒素-牛血清白蛋白复合物 ，弗氏完全佐剂与弗氏不完全佐剂，L-谷氨酰胺，牛血清白蛋白第五部分，聚乙二醇-1000， 2, 6, 10, 14-四甲基十五烷(Pristane )，邻苯二胺，二甲基亚砜，Tris， Hepes pH缓冲剂，免疫球蛋白，辣根过氧化氢酶，鼠抗IgG等，其它常规化学试剂均为优级纯、分析纯试剂；

（2）免疫动物

 8周龄BALB/c雄性小鼠用人工抗原杂色曲霉毒素-BSA进行二次免疫；每只小鼠基础免疫剂量为100 μg腹腔注射；24 d后加强免疫，剂量为每只小鼠100 μg，尾静脉注射，4 d后取脾融合；

（3）细胞融合

免疫小鼠脾细胞与骨髓瘤细胞Sp-2/0以10：1混合；

用50%分子量为1000的聚乙二醇作融合剂，融合细胞用含20%小牛血清的HAT选择性培养基悬浮后，接种于类似小鼠腹腔巨噬细胞作饲养层的96孔培养板中，于50% CO2，37℃条件下培养7 d后，每培养孔更换2/3HT培养液；9 d后，开始对镜检有杂交瘤克隆生长的培养孔，取上清液进行筛选，对检测结果呈阳性的细胞立即用有限稀释法进行克隆化；

（4）腹水抗体纯化

用硫酸铵盐析法纯化腹水抗体；

（5）杂交瘤筛选及抗体检测

杂交瘤筛选用固相抗原间接竞争性ELISA法进行：包被抗原杂色曲霉毒素-BSA的浓度为15 μg/mL，每孔加量120 μL；每孔所含抗体抗原反应物由80 μL培养上清液+2 μL经紫外分光光度计标定浓度的杂色曲霉毒素 (10 μg/mL)组成；检测对照中的抗原部分则用20 μL毒素稀释液(20%MeOH-PBS)代替；酶底物用邻苯二胺（OPD）；其它按标准方法进行；

（6）抗体的特性

①抗体滴度：

用固相抗原间接非竞争性ELISA测定，测试条件为：包被抗原为杂色曲霉毒素-BSA，浓度15 μg/mL，每孔加量150 μL；抗体从100倍开始对倍稀释，每孔加量130 μL；抗体稀释液为0.1%的BSA-PBS；阴性对照孔用SP-2/0骨髓瘤细胞培养上清液；封闭液为1% BSA-PBS，每孔加量250 μL；酶底物用OPD，其它按标准方法进行；

②检测标准毒素灵敏度：

先用棋盘滴定法筛选出包被抗原浓度和抗体工作稀释度的优化组合，以此为测试条件，用固相抗原间接竞争性ELISA法做出杂色曲霉毒素的标准抑制曲线，并对结果进行数理统计分析；其中ELISA测试条件为：包被抗原杂色曲霉毒素-BSA的浓度为5 μg/mL，每孔加量150 μL；抗体工作稀释度1：25600；抗体稀释液为0.1% BSA-PBS；抗体抗原反应液为每孔65 μL抗体+65 μL相应浓度杂色曲霉毒素；封闭液为1% BSA-PBS，每孔加量250 μL；酶底物为OPD；阴性对照用Sp-2/0骨髓瘤细胞培养上清液，其它按标准方法进行；

③抗体的特异性：

用固相抗原间接竞争性ELISA法测定，参试毒素为杂色曲霉毒素，构巢曲霉，黄曲霉，寄生曲霉，黄曲霉毒素马；其它测试条件同②；

④抗体亚类分析：

用免疫双扩散法进行；

⑤抗体的亲和力：

Friguet法，对应小鼠IgG标准曲线滴定出抗体IgG含量，再对应抗体滴度曲线求出平衡态下，抗体使抗原达到半饱和时的游离抗体克分子浓度[Ab]，代入下式求出抗体的亲和常数K（L/moL)，

Ka＝１/[Ab]

（7）样品中杂色曲霉毒素提取与纯化

II结果与讨论

（1）细胞融合与杂交瘤细胞的筛选细胞融合后，约57. 6% 的孔中长出杂交瘤克隆，其中抗体检测阳性率约为88%；从中选择对抗原有强抑制作用的孔，经多次亚克隆，建立了5个稳定分泌抗杂色曲霉毒素单克隆抗体的杂交瘤细胞株，各细胞株经两次亚克隆以后，阳性率已达到100% ；第3次克隆化时有反复(疑为假明性)，所以进行了4次亚克隆；将上述抗体纯化，即可。