[发明专利]一种产气肠杆菌特异性PCR检测引物

说明书

技术领域

本发明涉及一种用于检测的引物，具体涉及一种用于检测产气肠杆菌 PCR检测的引物，属于生物检测技术领域。

背景技术

产气肠杆菌(Enterobacter aerogenes)为革兰氏阴性菌，主要存在于人和动物的肠道内，亦可存在水、土壤及腐败物中，同时它也是一种重要的条件致病菌。当宿主机体状态改变或细菌进入肠道以外的部位，往往会引起感染。近年来，由于第三代和第四代头孢菌素、碳青酶烯类等超广谱抗菌药物在临床上的广泛使用，使该菌的耐药菌株明显增多，有些菌株已经表现为多重耐药。多重耐药使得临床上对该菌引起的疾病的治疗趋于复杂化。多重耐药的一个主要原因是未能在第一时间辨明病原菌，在不明病原菌的情况下，滥用药物，从而导致细菌的耐药性的出现，导致多重耐药的产生。因此，临床上迫切需要一种快速、精准的检测手段，辨明病原，从而针对性地防治。

传统的细菌鉴定方法主要是通过细菌生理生化特性进行分类，需要大量的时间进行生理生化反应的结果判读，不利于及时诊断病因，查找病原。PCR技术具有操作简便、快速、灵敏度高、特异性强等特点，已逐步应用于细菌的快速检测。然而，通过对现有技术的文献检索发现，目前尚未有利用PCR技术检测产气肠杆菌的报道。

发明内容

 本发明的目的在于提供一种产气肠杆菌特异性PCR检测引物。该引物可用于产气肠杆菌的PCR检测，具有检测时间短，成本低，检测结果特异性高，结果易判断，实用性强。

本发明是通过以下的技术方案实现的：

一种产气肠杆菌特异性PCR检测引物，包括正向引物和反向引物：

正向引物F：5’-GTAACCGGTGAAACCGAAAGC-3’

反向引物R：5’- GATGCCGCCTTCGTAGTGGAAATGG -3’。

所述引物在用于产气肠杆菌的PCR检测时，具体如下操作：

步骤一，提取样品DNA，PCR法扩增；

PCR检测体系为20 μL的反应体系，具体为：

10×PCR buffer(含Mg²⁺)    2 μL，

2.5mmol/L的dNTP       1.6 μL，

5 U/μL 的rTaq酶        0.16 μL，

20 μM的引物对          0.8 μL，

模板DNA               1-2 μL，

最后用灭菌双蒸水补至20 μL；

PCR检测反应程序为：94℃预变性4min；进入循环，94℃变性30s，58℃退火30s，72℃延伸45s，30个循环；72℃延伸5min，降温至4℃，结束。

步骤二，取10μL PCR扩增产物，1%琼脂糖凝胶电泳检测，判断样品种是否含有产气肠杆菌；所述判断具体为：1%凝胶电泳电泳检测扩增产物，若电泳结果在201bp出现单一条带，则说明样品种含有产气肠杆菌；反之，则样品中不含产气肠杆菌。

与现有技术相比，本发明具有如下的有益效果：采用本发明的检测方法检测产气肠杆菌所需时间短、特异性强、灵敏度高。本发明避免了采用传统鉴定方法操作繁琐、耗时长、准确性低、检出率低等缺点。同时，本发明所涉及的仪器设备、试剂等较为常用，一般基层实验室即可开展检测工作，实用性更强。本发明检测靶点具有单一特异性，检测结果特异，易于判定。 

附图说明

图1为实施例中PCR检测方法特异性评估实验凝胶电泳结果图；

图2为实施例中PCR检测方法灵敏度评价实验凝胶电泳结果图；

图3为实施例中临床样品检测凝胶电泳结果图。 

具体实施方式

下面结合具体实施例，进一步阐述本发明。应理解，这些实施例仅用于说明本发明而不用于限制本发明的范围。实施例中未注明具体条件的实验方法，通常按照常规条件例如Sambrook等分子克隆：实验室手册(New York：Cold Spring Habor Laboratory Press，1989)中所述的条件，或按照制造厂商所建议的条件。

步骤一，设计特异性扩增产气肠杆菌的引物对

引物序列为： F：5’-GTAACCGGTGAAACCGAAAGC-3’

R：5’- GATGCCGCCTTCGTAGTGGAAATGG -3’；

步骤二，DNA模板制备