[发明专利]缺失突变的chiB启动子及其组成型表达蛋白的应用

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别是一种经过基因操作产生的苏云金芽胞杆菌几丁质酶编码基因chiB突变的启动子序列及其应用。具体地描述，从苏云金芽胞杆菌总DNA中克隆出这一几丁质酶启动子序列，经过在其分子的5`-端和3`-端缺失部分碱基序列后，获得比原野生型启动子缩短的序列，该序列称为“chiBp△135”，将其与不同的表达载体连接，转化不同的苏云金芽胞杆菌，使该转基因细胞组成型表达其下游几丁质酶或其他目的基因的方法和应用。

背景技术

几丁质是含量仅次于纤维素的生物高分子物质,广泛存在于自然界中。几丁质酶（EC3.2.1.14）能特异性水解几丁质，将几丁质降解成几丁单糖以及几丁二糖[(GlcNAc)₂]、几丁三糖[(GlcNAc)₃]等分子大小不同的几丁寡糖[(GlcNAc)_n]。

1、几丁质酶在农业方面具有巨大的应用前景，为控制植物病虫害提供了很好的选择。绝大多数植物病原真菌细胞壁都含有大量的几丁质。不少体外抑菌研究证明，几丁质酶能抑制病原真菌孢子的萌发和菌丝的生长{Hoondal,2005#1941;Wang,2002#1965}。因此几丁质酶一直被认为是植物抗真菌病害的潜在物质。许多研究已经将细菌和植物几丁质酶基因转移到大豆、马铃薯、烟草、莴苣、番茄、葡萄及甜菜等植物中，获得了表达几丁质酶活性的转基因植物。Zhang等{Zhang,2011#2043}在催化植物生长根基细菌的基因组中整合枯草芽胞杆菌几丁质酶基因用于提高植物抗病原真菌的能力。这些植物与非转基因植物相比，它们不仅能抗真菌，而且对线虫、昆虫和其它一些病原生物也有一定的抗性。最近,Nature报道了脂质几丁寡糖可作为信号分子刺激植物内生真菌菌丝和菌根的形成，进而促进植物根部发育^[3]，这是几丁寡糖在农业应用方面的最新发现。

由于几丁质是昆虫甲壳及中肠围食膜的重要组成成分，几丁质酶破坏昆虫这些结构后，可以加速害虫罹病进程，提高死亡率。白僵菌素是著名的生物杀虫毒素，Fan等{Fan,2007#1976}通过在蚕白僵菌中联合表达外源几丁质酶来提高其杀虫活力。另外研究发现几丁质酶可以杀死或阻止发育阶段中的蚊子幼虫，由此可以设想利用几丁质酶来控制蚊子和由蚊子传播的疾病，而不需使用农药{Dahiya,2006#260}。

2、几丁质酶在工业上也具有重要的经济价值。它能提高很多有价值产品的产量。鉴于几丁质衍生物具有重要的药物价值，几丁质酶也用于生产几丁寡聚体、氨基葡萄糖和几丁单体。如，Hayes等{Hayes,2008#2331}利用几丁质酶从贝类废弃物中生产具有药用价值的壳聚糖；Wang等{Wang,2006#210}利用枯草芽胞杆菌的几丁质酶从贝类废弃物中获取能抑制癌细胞增生的几丁寡聚体；Makino等{Makino,2006#2336}利用芽胞杆菌和沙门氏菌的几丁质酶获得几丁寡聚体。几丁质酶也可直接用于人类卫生保健，例如几丁质酶用于生产眼药，可以作为抗真菌类护肤品的添加剂{Dahiya,2006#260}。在贝类加工中，固体废弃物的主要成份是几丁质、碳酸钙和蛋白。因此可以利用产几丁质酶的真菌生产酵母单细胞蛋白（SCP）。Cody等{Cody，1990#1940}报道曾试图使用几丁质酶将几丁质转变为乙醇。

3、几丁质酶在科学研究中也有重要应用。几丁质和壳聚糖是广泛存在于真菌细胞壁的多聚分子。利用几丁质酶和其它技术的结合可以定位真菌及植物细胞壁中的几丁质。Grenier等{Grenier,1991#1939}利用大麦几丁质酶和胶体金颗粒来定位真菌菌丝及孢子中的壳聚糖。真菌原生质体是研究细胞壁合成、酶的合成、分泌以及生物技术应用的良好实验材料。而几丁质是真菌细胞壁的组成成份，利用几丁质酶和其它细胞壁降解酶能有效的得到真菌原生质体。Hoondal等{Hoondal,2005#1941}利用肠杆菌（Enterobacter）的几丁质酶，有效的得到了瑞氏木霉（Trichoderma reesei），佛罗里达侧耳（Pleurotus florida）和双孢菇（Agaricus bisporus）等真菌的原生质体。

4、高分子量的几丁寡糖有明显的抗肿瘤作用，可激活巨噬细胞和淋巴细胞,增强机体免疫力,已用于抗癌的临床治疗以及药物和保健食品的开发领域^[4~6]。