[发明专利]一种用于检测溶血性链球菌的核酸适体、互补序列及检测方法

说明书

技术领域

本发明属于临床检验领域、食品检测领域，具体涉及一种以胶体金的荧光淬灭为基础的核酸适体、互补序列及检测溶血性链球菌的方法。

背景技术

溶血性链球菌呈球形或椭圆形，直径0.6-1.0μm，呈链状排列，长短不一，从4-8个至20-30个菌细胞组成不等，链的长短与细菌的种类及生长环境有关。该菌不形成芽胞，无鞭毛，易被普通的碱性染料着色，革兰氏阳性，老龄培养或被中性粒细胞吞噬后，转为革兰氏阴性。

该菌为需氧或兼性厌氧菌，营养要求较高，普通培养基上生长不良，需补充血清、血液、腹水，大多数菌株需核黄素、维生素B6、烟酸等生长因子。最适生长温度为37℃，在20-42℃能生长，最适pH为7.4-7.6。在血清肉汤中易成长链，管底呈絮状或颗粒状沉淀生长。在血平板上形成灰白色、半透明、表面光滑、边缘整齐、直径0.5-0.75mm的细小菌落，不同菌株溶血程度不一。

溶血性链球菌在自然界中分布较广，存在于水、空气、尘埃、粪便及健康人和动物的口腔、鼻腔、咽喉中，可通过直接接触、空气飞沫传播或通过皮肤、粘膜伤口感染，被污染的食品如奶、肉、蛋及其制品也会对人类进行感染。一般来说，溶血性链球菌常通过以下途径污染食品：1、食品加工或销售人员口腔、鼻腔、手、面部有化脓性炎症时造成食品的污染；2、食品在加工前就已带菌、奶牛患化脓性乳腺炎或畜禽局部化脓时，其奶和肉尸某些部位污染；3、熟食制品因包装不善而使食品受到污染。

溶血性链球菌是一种常见的病原微生物，可引起食物中毒与临床感染，感染人体可导致新生儿败血症、脑膜炎、肺炎等多种严重感染性疾病，甚至死亡。溶血性链球菌感染具有传染源广，危害大等特点，同时该菌的自然来源较广。其相关检测技术较繁琐，检测周期长，按照国家食品微生物检测标准GB4789程序培养检测需要3天时间，同时仪器设备硬件要求高。随着分子生物学的发展，现在已建立了以PCR为基础的多项检测技术如免疫PCR、实时定量PCR、多重PCR，及以抗原检测为主的免疫学检测法。针对溶血性链球菌scpA基因设计特异性LAMP扩增引物，进行等温扩增，能有效地检出致病性溶血性链球菌。这些检测方法快捷、灵敏，准确度较高。但是，这些针对单一族溶血性链球菌的现代检测方法均需一定的设备和技术要求，且试剂费用较贵，难以推广普及。因此，建立溶血性链球菌特别是致病性菌株的准确快速检测对于控制该类细菌引起的食物中毒具有重要意义因此进一步探索该菌的快速、灵敏的检测方法对食品中该菌的污染监测、该菌的疾病诊断和流行病学调查显得尤为重要。

发明内容

本发明的目的在于提供以胶体金淬灭荧光为基础的一种用于检测溶血性链球菌的核酸适体、互补序列及检测方法，本发明的方法能快速、特异、灵敏地检测溶血性链球菌。

为实现上述目的，本发明采取的技术方案为：一种用于检测溶血性链球菌的核酸适体及其互补序列，核酸适体的序列命名为序列A，互补序列命名为序列B，具体序列如下：

序列A：5’-CAGATGCACACGCTGAAGAAA

CTGAGGTCGTAGGTTTTCTTCGGG-3’；

序列B：5’-CGTGTGCATCTGAAAAAAAAAA-SH3’；

其中序列A的5’端有荧光报告基团。

进一步的，所述的荧光报告基团为FAM。

本发明还提供了一种用于检测溶血性链球菌的检测方法，其特征在于，包括如下步骤：

1)采用常规方法制备纳米金颗粒；

2)纳米金颗粒与互补序列反应，形成互补寡核苷酸的纳米金颗粒覆盖体；

3))将步骤2制备的互补寡核苷酸的纳米金颗粒覆盖体，与权利要1或2所述的核酸适体反应，覆盖体上的纳米金颗粒猝灭核酸适体上的荧光报告基团发出的荧光信号；

4)在步骤3的反应体系中，加入溶血性链球菌，溶血性链球菌与核酸适体特异性结合，使其与覆盖有纳米金颗粒的互补寡核苷酸分离，释放出的核酸适体标记的荧光基团使荧光信号重新恢复。

用荧光分光光度计测量荧光信号强度以检测溶血性链球菌的量，其最低检测限为33CFU/ml。

本发明采用纳米金颗粒与核酸适体序列结合快速检测溶血性链球菌的原理：利用与溶血性链球菌特异性结合的单链DNA核酸适体既可以与靶蛋白特异结合又能与互补寡聚核苷酸形成双链的特点，利用纳米金颗粒猝灭荧光染料的特点，通过将溶血性链球菌引入到体系中后荧光信号的改变，用荧光分光光度计测量荧光信号强度来实现对溶血性链球菌的分析。