[发明专利]一种流感病毒滴度的检测方法

说明书

技术领域

本发明涉及一种流感病毒感染滴度的检测方法，属于生物技术领域。

背景技术

传统的流感病毒病毒滴度的检测方法是利用鸡胚法。选择9～11日龄的鸡胚，将流感病毒按10倍系列稀释，至少取3个稀释度尿囊腔注射，每只注射0.2ml.每个稀释度注射4只鸡胚。37℃孵箱培养3天，取尿囊液做血凝滴度检测。计算出病毒滴度。利用空斑法检测病毒滴度的方法早在50年代就开始研究使用了。1952年，Dulbecco把噬菌体空斑技术应用于动物病毒学，从而使病毒蚀斑技术(Virus plaque formation)成为许多病毒的滴定和研究方法。病毒感染细胞后，由于固体介质的限制，释放的病毒只能由最初感染的细胞向周边扩展。经过几个增殖周期，便形成一个局限性病变细胞区，此即病毒蚀斑。从理论上讲，一个蚀斑是由最初感染细胞的一个病毒颗粒形成的，因而该项技术常用于病毒颗粒计数和分离病毒克隆。但在实际操作中，常出现几个病毒颗粒同时感染一个细胞的情况，影响滴定的准确性和克隆的纯一性，为此，接种的病毒液要充分分散和稀释。对于细胞结合性病毒，如MDV，需用单层细胞；对细胞释放性病毒，即可用固相介质悬浮的细胞，也可用单层细胞，但后者需用琼脂等固体介质盖在细胞上，以防释放的病毒在液体介质中流动。固体介质的浓度由病毒的大小而定，大病毒用浓度较低的介质，小病毒用浓度较高的介质，以便将蚀斑的生长速度控制在适宜的范围内。小蚀斑需用显微镜观察，1-10mm的大蚀斑可用肉眼计数。为便于肉眼观察，常用中性红等染料染色。因病变细胞不吸收中性红，病变细胞区便呈现无色蚀斑。病毒悬液的滴度以每毫升蚀斑形成单位(PFU/ml)来表示。例如，3个细胞瓶的平均蚀斑是58，接种量为0.2ml，病毒的稀释度为2.5×10³，则病毒原液的滴度为：58÷0.2×2.5×10³＝7.25×10⁵(PFU/ml)。

蚀斑技术可以应用于分离病毒的克隆(无性繁殖纯系)、病毒或血清的滴定，也可用蚀斑形态和大小研究病毒的生物学特性。

1.病毒生物学纯化(Virus biological purification)在进行血清中和试验时，常常会出现标准病毒株的滴度下降，因而影响了试验的准确性，这种情况多见于虫煤病毒。这可能是由于原始毒种的混杂，或者已有许多变异病毒粒子存在其中，甚至出现数量众多的缺陷病毒所致。这时，有必要把手上掌握的标准毒株进行纯化，应用病毒蚀斑技术，挑选出各个不同的纯化病毒，亦称“克隆株”。克隆后的病毒经在敏感细胞上增殖，测定其滴度，选用合适的毒株用于血清中和试验。为了更有效地进行纯化，必须在覆盖营养琼脂之前用营养液洗去单层细胞上未被吸附的病毒。同时要控制好稀释的浓度，一个培养瓶中的蚀斑数目最好不超过10个，挑取在其附近10mm都是健康细胞的蚀斑。挑取后的病毒应传两代或两代以上。一般认为，中性红染料会由于“光敏”作用而抑制病毒蚀斑的形成和破坏宿主细胞。因此，加了中性红覆盖层的培养物应在暗处培养。

2.蚀斑减少中和试验(Plaque Reduction Neutralization Test)蚀斑减少中和试验是检测血清中和抗体的一种敏感性较高的方法，试验以使蚀斑数减少50％的血清稀释度作为其中的效价。试验使用定量的病毒(100PFU)与不同稀释度的等量血清混合后感作，接种预先准备好的单层细胞，再覆盖上营养琼脂置37℃二氧化碳培养箱培养，数天后分别统计蚀斑数，用Karber法计算该血清的蚀斑中和效价。其操作原理与传统的血清中和试验大致相同。

发明内容

本发明的目的在于公开了一种利用Vero细胞空斑法检测流感病毒感染滴度的检测方法。

本发明给出的技术方案是：这种流感病毒滴度的检测方法，其特征在于：采用Vero细胞空斑法检测流感病毒感染滴度，其步骤有：

(1)将流感病毒10倍系列稀释，取各稀释度病毒液加入Vero细胞6孔板中，每孔加入0.5ml，每个稀释度加4孔。35℃吸附90min后倒掉病毒液。

(2)加入保持37℃～42℃的第一层覆盖物，每孔3ml。完全凝固后35℃倒置培养72小时。

(3)加入保持37℃～42℃的第二层覆盖物，每孔2ml。完全凝固后35℃倒置培养24～48小时判定结果。选择出斑数在10～100个进行数斑。

(4)采用Vero细胞空斑法检测流感病毒感染滴度。