[发明专利]一种流感病毒滴度的检测方法

权利要求书

1.一种流感病毒滴度的检测方法，其特征在于：采用Vero细胞空斑法检测流感病毒感染滴度，其步骤有：

(1)将流感病毒按10倍系列稀释，取各稀释度病毒液加入Vero细胞6孔板中，每孔加入0.5ml，每个稀释度加4孔，，35℃吸附90min后倒掉病毒液；

(2)加入保持37℃～42℃的第一层覆盖物，每孔3ml，完全凝固后35℃倒置培养72小时；

(3)加入保持37℃～42℃的第二层覆盖物，每孔2ml，完全凝固后，35℃倒置培养24～48小时判定结果，选择出斑数在10～100个进行数斑；

(4)根据Vero细胞空斑法检测流感病毒感染滴度：

(5)将流感病毒稀释至每0.5ml含1～5个病毒(即每孔1～5个空斑)，分别用鸡胚法和空斑法检测流感病毒感染滴度，检测阳性检出率，比较两种方法的灵敏度；

(6)分别采用终浓度为1％和0.5％的Agarose覆盖物，进行试验操作，比较不同的终浓度对出斑的影响；

(7)35℃培养箱流感病毒分别吸附60min和90min后加入第一层覆盖物，比较不同吸附时间对出斑的影响；

(8)流感病毒在33℃和35℃培养时能很好的繁殖，但在较高温度时繁殖减弱，甚至不繁殖；

(9)按上述方法，五个不同操作者同时用空斑法检测同一个流感病毒感染滴度，分别重复5次以上，对结果进行分析。

2.根据权利要求1所述流感病毒滴度的检测方法，其特征在于采用Vero细胞空斑法检测流感病毒感染滴度的病毒稀释液为含6ug/ml胰酶的无血清培养基。

3.根据权利要求1所述流感病毒滴度的检测方法，其特征在于采用Vero细胞空斑法检测流感病毒感染滴度的第一层覆盖物为每100ml含2倍无血清培养基43.2ml、2％Agarose50ml、7.5％NaHCO3 3ml、HEPES 1.5ml、3％谷氨酰胺1ml、0.25％胰酶0.3ml、双抗1ml。

4.根据权利要求1所述流感病毒滴度的检测方法，其特征在于采用Vero细胞空斑法检测流感病毒感染滴度的第二层覆盖物为每100ml含2倍无血清培养基38.2ml、2％Agarose50ml、7.5％NaHCO3 3ml、HEPES 1.5ml、3％谷氨酰胺1ml、0.25％胰酶0.3ml、双抗1ml、中性红5ml。

5.根据权利要求1所述流感病毒滴度的检测方法，其特征在于采用Vero细胞空斑法检测流感病毒感染滴度时加入保持40℃的第一层覆盖物，每孔3ml，完全凝固后35℃倒置培养72小时。

6.根据权利要求1所述流感病毒滴度的检测方法，其特征在于采用Vero细胞空斑法检测流感病毒感染滴度时加入保持40℃的第二层覆盖物，每孔2ml，完全凝固后35℃倒置培养24～48小时判定结果。

7.根据权利要求1所述流感病毒滴度的检测方法，其特征在于采用Vero细胞空斑法检测流感病毒感染滴度时选择出斑数在30～70个进行数斑。

8.根据权利要求1所述流感病毒滴度的检测方法，其特征在于采用Vero细胞空斑法检测流感病毒感染滴度的