[发明专利]治疗耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌感染的生物试剂

权利要求书

1.一种治疗耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌感染的生物试剂，其特征在于：所述生物试剂为噬菌体AB3裂解酶的蛋白质溶液，该噬菌体AB3裂解酶的氨基酸序列为：

MILTKDGFGIIRNELFGGKLDQNQVDAINFIIEKSTESGLTYPEAAYLLATIYHETGLPSGYRTMRPIKEAGSDSYLRSKKYYPYIGYGYVQLTWKDNYERIGKLIGIDLVKNPEKALEPLIAIQIAIKGMLNGWFTGVGFRRKRPVSKYNKQQYIAARNIINGKDKAELIAKYAIIFERALRSL   SEQ N01；所述合成噬菌体AB3裂解酶的基因序列为：

5’-ATGATTCTGACTAAAGATGGGTTTGGTATTATCCGTAATGAGTTATTCGGAGGTAAGTTAGATCAAAATCAAGTAGATGCAATAAACTTTATTATTGAGAAATCTACTGAGTCTGGTCTAACTTATCCAGAGGCAGCATATTTACTAGCTACCATTTATCATGAGACTGGTTTACCAAGTGGTTATCGAACTATGCGACCAATTAAGGAAGCTGGCTCTGATAGCTACCTTCGATCTAAGAAGTACTACCCTTACATCGGTTATGGTTATGTACAATTAACTTGGAAGGATAACTATGAACGTATCGGTAAACTTATTGGAATTGATCTGGTCAAGAATCCTGAGAAAGCCCTAGAACCATTAATTGCTATTCAAATTGCTATCAAAGGTATGTTGAATGGTTGGTTCACAGGTGTTGGGTTCCGACGTAAACGTCCAGTTAGTAAATACAACAAACAACAGTACATAGCTGCTCGTAATATCATTAATGGGAAGGATAAGGCTGAGCTTATAGCGAAGTACGCTATTATCTTTGAACGTGCTCTACGGAGCTTATAG-3’SEQ N02。

2.一种如权利要求1所述噬菌体AB3裂解酶的制备方法，其特征在于，按照如下步骤完成：

A、噬菌体AB3的分离与纯化：

取医院污水适量，将处于早期对数生长期的耐碳青霉烯类鲍曼不动杆菌悬液和LB 50ml加入到污水中37℃，24h。离心后过滤除菌。10μl处理后的污水与200μl宿主菌混合20min后，与2ml顶层琼脂混匀铺板。单个噬斑经过5次反复纯化后即可得到均匀的噬菌体；

B、提取噬菌体AB3的DNA：

(1)挑单个细菌菌落接种于200mL液体LB培养基中，37℃振荡培养6h，至早期对数生长期；

(2)挑噬菌体AB3单个噬斑分别接种到对应宿主菌悬液中，37℃振荡培养16h；

(3)培养物加DNase I及RNase A至终浓度各1μg/mL，37℃×1h；

(4)按5.84g/100mL加入NaCl，混匀溶解，冰浴1h，离心10000g×10min，收集上清；

(5)加入固体PEG 8000至终浓度10％(w/v)，充分振荡溶解，冰浴3h，使噬菌体颗粒形成沉淀，4℃离心12000g×10min，弃尽上清；

(6)用2mL TM液混悬沉淀；

(7)加等体积氯仿，振荡30sec，离心5000g×10min，收集上层水相；

(8)加DNase I至终浓度5μg/mL，RNase A至终浓度1μg/mL，37℃温育1h；

(9)然后加入EDTA(pH8.0)至终浓度20mmol/L；

(10)加蛋白酶K至终浓度50μg/mL，加SDS至终浓度0.5％，混匀，56℃×1h；

(11)等体积平衡酚(pH8.0)抽提，离心5000g×10min，收集上层水相；

(12)等体积氯仿再抽提一次，离心5000g×10min，收集上层水相；

(13)加入1/10体积3mol/L NaAc(pH5.2)，再加入两倍体积的无水乙醇沉淀核酸，-20℃过夜，4℃离心12000g×10min；沉淀用70％乙醇和无水乙醇各洗涤一次，去乙醇，空气中干燥沉淀；

(14)用适量TE(pH8.0)混悬沉淀，在核酸定量仪上粗略定量，-20℃保存；

C、噬菌体AB3 DNA的酶切分析：

取上述得到的噬菌体核酸溶液，常规进行酶切。于0.8％琼脂糖凝胶中电泳，90V电压1h。使用限制性内切酶Hind III、BamH I、EcoR I、Pst I、XbaI、Xho I、Bg lII、Aat II、Dra I、Nhe I、Sac I和Sa II分别消化噬菌体核酸；

D、噬菌体AB3衣壳蛋白SDS-PAGE分析；

灌注10％分离胶，聚合后再灌注5％积层胶。用5×SDS-PAGE上样缓冲液混合样品，100℃10min后立即移至冰上冷却。离心后逐孔加样，最后将1×SDS-PAGE的上样缓冲液加入剩余孔。给予8V/cm电压，待染料前端进入分离胶后，15V/cm电压继续电泳，直至溴酚蓝到达分离胶的底部；

E、噬菌体AB3裂解酶基因的PCR反应扩增；

PCR反应扩增的引物：

正向引物：5’-TATACCATGGGCATGATTCTGACTAAAGA-3’SEQ NO3

反向引物：5’-GGTGCTCGAGTAAGCTCCGTAGAGCACGT-3’SEQ NO4

1)试管编号(N)：N＝样本编号数量+1个阴性对照

2)PCR反应体系

3)PCR循环体系：

4)1.5％琼脂糖凝胶检测：

在1.5％琼脂糖凝胶上电泳，检测条带的是否存在；

F、原核表达载体的构建；

噬菌体AB3裂解酶基因以Nco I和Xho I酶切位点装入pET28a载体中，在蛋白C端引入6His tag作为亲和纯化标签。经测序验证正确后，在大肠杆菌中表达；

G、噬菌体AB3裂解酶基因的表达及纯化；

将噬菌体AB3表达质粒转化到表达菌株BL21(DE3)中，第二天挑单克隆到200ml LB培养基中，37℃培养至OD600＝0.6，加入1mM IPTG分别于25℃诱导表达20h，37℃诱导表达6h。诱导后，离心收集菌体。PBS溶液悬起菌体，超声波破碎菌体，4℃冷冻离心，上清部分用Ni柱纯化，以含50mM咪唑PBS溶液洗涤杂蛋白，以含500mM咪唑的PBS溶液洗脱。并取样SDS-PAGE检测。