[发明专利]南美白对虾传染性肌肉坏死病的检测方法及试剂盒

说明书

技术领域

本发明属于生物技术领域，特别涉及一种南美白对虾传染性肌肉坏死病的检测方法及试剂盒。该检测方法为实时荧光定量PCR方法。

背景技术

近年动物世界卫生组织(OIE)报道了一种新发现的主要感染南美白对虾的严重病毒，初步定名为传染性肌肉坏死病毒(Infectious Myonecrosis Virus，IMNV)，该病发现于南美，目前已证实传入亚洲，并列入了亚太地区水生动物监测季度报告(QAAD)的病害监测名录，OIE将该病列入OIE的重点水生动物疫病名录。2002年巴西初次发生传染性肌肉坏死病，主要危害南美白对虾。引起该病的病原体为双链RNA病毒简称IMNV，为一个全新的病毒。中华人民共和国农业部2008年12月11日发布的第1125号公告，将传染性肌肉坏死病新增为二类动物疫病，为甲壳类感染的六种二类动物疫病之一。IMNV能使6克左右南美白对虾发生高达50％的致死率。本病2004年仅在巴西就造成超过1亿美元的经济损失。2006年已经传到亚洲的印度尼西亚。我国海南、福建、汕头等地也有报道，但尚未证实。由于我国的南美白对虾养殖面积大，并且在养殖过程中苗本和亲本的大规模国际、跨区域移动现象十分普遍，因此，该病传入我国并扩散的风险很大，应引起各级政府及广大对虾养殖业者的高度重视。美国、印度尼西亚和我国台湾等地的学者已经进行了该病毒的初步的流行病学研究，并在GenBank中发布了两条全序列。美国亚利桑那大学(University ofArizona)水产病害实验室为研究该病毒国际上最权威的实验室之一，已经尝试建立该病毒的PCR鉴定方法。但在国内除了朱泽闻和赵文武2007年提出“南美白对虾养殖应警惕传染性肌肉坏死病毒”，闫冬春2009年综述了“对虾传染性肌肉坏死病的研究进展”外，再无其他的文献报道。OIE虽然发布有该病毒的荧光PCR检测方法，但从作者的工作实践结果来看，其敏感性不高，扩增效果不好，因此有必要重新设计一个快速、准确的新的检测方法。

发明内容

本发明的首要目的是克服现有技术的缺点与不足之处，提供一种南美白对虾传染性肌肉坏死病的检测方法。该检测方法速度快且准确率高。

本发明的另一目的在于提供实现所述检测方法的试剂盒。

本发明通过下述技术方案实现：一种南美白对虾传染性肌肉坏死病的检测方法，包含以下步骤：

(1)设计实时荧光定量PCR所需要的引物和探针如下所示，方向5’→3’，探针标记荧光基团为FAM、淬灭基团TAMRA：

正向引物CPI-603：GGGAGTAGATATAAATGTTCAG；

反向引物CPI-732：CAACCACCCAAATTCATA；

探针PCPI-712：FAM-CACCTGCTACCACTTCTTCTCTT-TAMRA。

(2)检测：以南美白对虾肌肉组织为材料提取RNA，逆转录，得到cDNA；以cDNA为模板，在荧光PCR反应体系中加入步骤(1)设计的引物和探针，设定实时荧光PCR仪反应程序，进行实时荧光PCR，从而检测出所检测的南美白对虾是否为传染性肌肉坏死病毒阳性；

步骤(2)中所述的实时荧光定量PCR反应体系优选为：每25μL反应体系中10×Taq DNA聚合酶buffer(含Mg²⁺)2.5μl、10mM dNTP1μL、Taq DNA聚合酶0.5μL、正向引物CPI-603、反向引物CPI-732以及探针PCPI-712；正向引物CPI-603和反向引物CPI-732的终浓度分别为0.1μmol/L、探针PCPI-712的终浓度为0.06μmol/L；

步骤(2)中所述的实时荧光PCR的条件优选为：48℃5min；95℃5min；95℃15s，60℃15s，40个循环；

实现上述南美白对虾传染性肌肉坏死病核酸检测方法的试剂盒，包含正向引物、反向引物和荧光标记探针，其中引物和探针如下：

正向引物CPI-603：5′-GGGAGTAGATATAAATGTTCAG-3′；

反向引物CPI-732：5′-CAACCACCCAAATTCATA-3′；

探针PCPI-712：5′-FAM-CACCTGCTACCACTTCTTCTCTT-TAMRA-3′；

所述的试剂盒还包含RT-PCR缓冲液、逆转录反应酶混合物、DEPC处理水。