[发明专利]马铃薯Y病毒阳性对照品的制备方法

说明书

技术领域

本发明涉及病毒阳性对照品的制备方法。

背景技术

马铃薯是中国第四大粮食作物，然而整体生产水平却低于世界平均水平，其中最重要的原因就是病毒病严重影响了马铃薯的产量和品质。

马铃薯Y病毒(Potato virus Y，PVY)是危害马铃薯的重要病毒之一，分布于世界各个马铃薯产区，可通过蚜虫以非持久方式传播，导致马铃薯退化、产量降低，严重时减产可达80％以上。特别是PVY在茄科作物上往往与马铃薯X病毒(PVX)发生协生作用，加剧了病毒病的危害，造成巨大的经济损失。

目前最有效的防治措施是推广脱毒种薯并加强检测工作，有效的检测方法是保证生产安全的重要措施，国内外常规检测普遍采用病毒检测试剂盒，应用DAS-ELISA技术进行PVY检测，实验检测结果需要用病毒的阳性对照即马铃薯Y病毒冻干粉来判断结果是否准确，对实验能否顺利开展起着至关重要的作用，而该试剂盒全世界只有不足十家企业销售，目前国内PVY病毒检测几乎完全依赖进口试剂盒，价格昂贵，限制了检测技术的推广普及，从而限制了马铃薯种薯质量的提高和产业的发展。另外，进口试剂盒存在以下缺点：(1)价格昂贵：进口试剂盒中的阳性对照价格昂贵，每瓶需要300元左右；(2)保质期短：进口试剂盒中的阳性对照保质期为1年左右，如对阳性对照的冻干粉进行稀释或者稀释后反复冻融，保质期还将大大缩短，而且检测结果值很低，不利于检测结果的判断；(3)不利于推广普及：由于价格昂贵，1套马铃薯Y病毒试剂盒中只有1瓶阳性对照，由于需要多次检测，每次检测都需要用阳性对照，因此，经过反复冻融，保质期缩短，检测值低，影响检测结果。从而使马铃薯Y病毒的检测试剂盒的应用受到限制，不利于推广普及。

发明内容

本发明目的是为了解决现有PVY病毒检测试剂盒中的阳性对照价格昂贵、保质期短以及不利于推广普及的问题，而提供马铃薯Y病毒阳性对照品的制备方法。

马铃薯Y病毒阳性对照品的制备方法按以下步骤实现：

一、将10g的PVY繁殖寄主叶片和120mL的提取缓冲液混合后进行研磨，然后用双层纱布过滤，得到病毒汁液；

二、将0.06～0.12g的明胶和80mL的提取缓冲液混合，加热至融化，然后加入6～10g的蔗糖，继续加热至蔗糖融化，倒入病毒汁液中混匀，再倒入青霉素瓶中，每瓶加入1～2ml，盖上瓶塞并放入冷冻干燥机中抽干，得到马铃薯Y病毒的冻干粉，即完成马铃薯Y病毒阳性对照品的制备；

其中步骤一中提取缓冲液每100mL由20g的PVP-40000、8.0g的NaCL、0.2g的KH₂PO₄、2.9g的Na₂HPO₄·12H₂O、0.2g的KCL、0.2g的NaN₃、0.5mL的Tween20和余量的蒸馏水组成。

本发明制备的马铃薯Y病毒阳性对照品的有益效果是：(1)价格低：马铃薯Y病毒阳性对照每瓶价格为100元，而进口阳性对照的价格是300元左右，是进口价格的1/3；

(2)保质期长，检测灵敏度高：对产品进行了保质期、检测灵敏度的跟踪实验，经验证该产品保质期达3年以上，DAS-ELISA检测结果值达2.000以上；

(3)利于推广普及：价格低廉、检测结果准确、保质期长，配合黑龙江省农业科学院生产的PVY病毒检测试剂盒使用，利于推广普及。

具体实施方式

具体实施方式一：本实施方式马铃薯Y病毒阳性对照品的制备方法按以下步骤实现：

一、将10g的PVY繁殖寄主叶片和120mL的提取缓冲液混合后进行研磨，然后用双层纱布过滤，得到病毒汁液；

二、将0.06～0.12g的明胶和80mL的提取缓冲液混合，加热至融化，然后加入6～10g的蔗糖，继续加热至蔗糖融化，倒入病毒汁液中混匀，再倒入青霉素瓶中，每瓶加入1～2ml，盖上瓶塞并放入冷冻干燥机中抽干，得到马铃薯Y病毒的冻干粉，即完成马铃薯Y病毒阳性对照品的制备；

其中步骤一中提取缓冲液每100mL由20g的PVP-40000、8.0g的NaCL、0.2g的KH₂PO₄、2.9g的Na₂HPO₄·12H₂O、0.2g的KCL、0.2g的NaN₃、0.5mL的Tween20和余量的蒸馏水组成。