[发明专利]一种hTERTmRNA的TRPCR检测试剂盒及检测方法

说明书

（一）技术领域

本发明涉及一种端粒酶催化亚基（hTERT）mRNA的预备模板PCR（Template-Ready PCR，TRPCR）检测试剂盒及检测方法。 

（二）背景技术

端粒酶（telomerase）是一种特殊的逆转录酶，是由RNA和蛋白质组成的核糖核蛋白（RNP）复合物，包含3个主要成分：端粒酶RNA（hTR）模板，端粒酶催化亚单位（hTERT）和 端粒酶相关蛋白（hTLP）。hTR是端粒酶进行延伸反应的模板，约有450个碱基，其中包含5'-CUAACCCUAAC-3'的模板序列；hTERT是端粒酶逆转录酶的蛋白催化亚基，hTLP是端粒酶的调节单位。端粒酶的主要功能是利用染色体末端（端粒）的3'末端为引物，以自身RNA为模板合成端粒-TTAGGG-重复序列添加到染色体末端，从而维持端粒原有长度，使端粒的稳定和保护染色体的功能得以延续，细胞因逃逸渐进性衰老而达到“永生化”。在一些特定的组织细胞，如：生殖细胞、胚胎细胞、造血干细胞、外周血淋巴细胞、毛发、皮肤、子宫内膜等分裂旺盛的组织细胞中有低水平的活化端粒酶的表达， 但在正常成熟的体细胞中则没有端粒酶活性，这些体细胞因为端粒的逐渐缩短而导致衰老和死亡。极少数体细胞可能偶然通过激活端粒酶而逃逸程序性老化，其生存延长可能给另外的基因损伤的积累提供机会， 导致进行性肿瘤性发展，即癌变，因此，端粒酶的重新激活是体细胞向肿瘤细胞转化，即癌变的关键步骤。对大量的临床标本的检测表明，绝大多数的肿瘤细胞都呈端粒酶阳性（>85%），而在癌旁组织和正常组织的端粒 酶阳性率很低（<5%），因此，端粒酶是一个被广泛接受的特异性很高的肿瘤标志物。细胞内端粒酶的调控主要是通过hTERT的表达调控来实现的，hTERT mRNA的表达水平在癌细胞中有明显上调，因此，对hTERT mRNA的检测可能发展成为对癌症进行检测和分子诊断的有力手段。 

RT-PCR （reverse transcription逆转录-聚合酶链反应），指将逆转录（Reverse Transcription，RT）反应和PCR（Polymerase Chain Reaction）反应组合在一起的方法。RT- PCR将以RNA为模板的cDNA合成同PCR结合在一起，提供了一种分析基因表达的快速灵敏的方法。然而，RT-PCR在临床检测应用方面，存在很大的改进空间，主要问题是：（1）依赖于逆转录反应，且2步酶促反应（逆转录和PCR）的最优反应条件是有差异的，体系优化受到限制；（2）需要严格预防和抑制RNA酶的污染，需要提取纯化RNA，前处理的过程复杂，操作要求高，步骤繁琐，耗时长；（3）容易受到各种抑制物质的影响， 容易受到假阳性的困扰；（4）逆转录酶的价格居高不下，操作成本很难降下来；（5）对于低丰度RNA的检测灵敏度不够高的时候，需要采用非常复杂和容易污染的套式PCR。 

（三）发明内容

本发明目的是提供一种操作简单快速、特异性强的用于端粒酶催化亚基（hTERT）检测的试剂盒及检测方法。 

本发明采用的技术方案是： 

一种端粒酶催化亚基（hTERT）mRNA的预备模板PCR检测试剂盒，主要包括： 

（1）管内固定有探针A的锚定PCR管；所述探针A核苷酸序列如下：5’-GACTCAGCTGCGTCTGGGCTGTCCTGAGTGACCCCA-3’； 探针 A是与目标RNA上一段序列互补的单链寡核苷酸DNA，这段序列位于下面所述的探针B互补结合的区域之外；探针A的锚定可以采用本领域常规方法进行，用于锚定探针A的固体介质，可以是塑料离心管，也可以是磁珠，凝胶颗粒或其他可以吸附结合核酸的固体介质； 

（2）探针B，其核苷酸序列如下：5’-CCGGAGGAAAGCGTGGACACCCTCCTTCAGGCAGGACACCTGGCGGAAGGAGGGGGCCGACGGTTGAGGTTTCGGCG-3’； 探针B 是包含与目标RNA上另一段序列互补的单链寡核苷酸DNA，其结构为: 两端是特异的PCR引物序列，中间为与目标RNA序列的互补序列； 

（3）PCR引物： 

NTP1：5’- CCGGAGGAAAGCGTGGACACC -3’ 

NTP2：5’- CGCCGAAACCTCAACCGTCG -3’； 

（4）裂解液；所述裂解液为本领域常规含有表面活性剂（如吐温20、NP-40等）、用于细胞裂解的缓冲液；