[发明专利]一种hTERTmRNA的TRPCR检测试剂盒及检测方法

权利要求书

1.一种端粒酶催化亚基（hTERT）mRNA的预备模板PCR检测试剂盒，主要包括：

（1）管内固定有探针A的锚定PCR管；所述探针A核苷酸序列如下：5’-GACTCAGCTGCGTCTGGGCTGTCCTGAGTGACCCCA-3’；

（2）探针B，其核苷酸序列如下： 5’-CCGGAGGAAAGCGTGGACACCCTCCTTCAGGCAGGACACCTGGCGGAAGGAGGGGGCCGACGGTTGAGGTTTCGGCG-3’；

（3）PCR引物：

NTP1：5’- CCGGAGGAAAGCGTGGACACC -3’

NTP2：5’- CGCCGAAACCTCAACCGTCG -3’；

（4）裂解液；

（5）PCR缓冲液；

（6）洗涤液。

2.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述裂解液组成如下：1% SDS，500mmol/L NaCl，2mmol/L MgCl₂，10mmol/L 2-巯基乙醇，0.1mg/ml 鱼精DNA，0.1% Tween20，1% 脱脂奶粉，溶剂为10mmol/L、pH7.5的Tris-HCl。

3.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述PCR缓冲液组成如下： 50mmol/L KCl，1.5mmol/L MgCl₂，0.2mmol/L dNTP，5% DMSO，0.05% Tween20，0.4×SYBR Green I，0.5U/20ul Taq酶，溶剂为10mmol/L、pH9.0的Tris-HCl 。

4.如权利要求1所述的试剂盒，其特征在于所述洗涤液为TBST缓冲液。

5.利用如权利要求1所述试剂盒检测端粒酶催化亚基mRNA的方法， 所述方法包括：

（1）取待测样本，加入探针B和裂解液，反复吸打，转移至离心管中，冰上放置20min，4℃离心，取上清液，得到裂解上清液；

（2）取裂解上清液20uL至锚定PCR管中，60~70℃保温5~15min，吸干管内液体，以洗涤液洗涤3~9次，吸干，加入20uL 由PCR缓冲液和PCR引物配制的PCR反应液，进行PCR扩增，扩增产物进行SYBR荧光定量分析；

（3）以空白裂解液作为阴性对照，按照步骤（1）和（2）方法进行处理和分析，以空白裂解液Ct值减去样本Ct值的差值大于或等于1，判断样品为阳性。

6.如权利要求5所述的方法， 其特征在于所述PCR扩增条件如下：93℃预变性3min；然后93℃ 3s、66℃30s，35个循环。